Аммония сульфат удаление диализом

Растворимость белков зависит также от наличия других растворенных веществ. Например, некоторые белки не растворяются в дистиллированной воде, но растворяются в присутствии небольших концентраций нейтральных солей. При высоких концентрациях нейтральных солей белки выпадают в осадок, причем для осаждения (высаливания) разных белков требуются разные концентрации соли. Следовательно, этим способом можно фракционировать белки. Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют сульфат аммония. После удаления соли (например, путем диализа) осажденный белок вновь растворяется при этом сохраняются его нативные свойства. [c.47]

При очистке белков используют помимо указанных выше методов фракционирования также и ряд вспомогательных процедур. Особенно важны две из них —диализ и лиофилизация. Диализ, или удаление соли из раствора белка, заключается в пассивном переносе ионов из раствора белка через непроницаемую для белка мембрану в буферный раствор этот метод известен давно и применяется очень широко. Освобождение белка от соли путем диализа необходимо проводить на многих стадиях очистки, в частности после осаждения белка сульфатом аммония. Другой метод обессоливания — пропускание белкового раствора через соответствующие молекулярные сита. [c.81]

Высаливание. При добавлении растворов солей щелочных и щелочноземельных металлов происходит осаждение белков из раствора. Обычно белок не теряет способности растворяться вновь в воде после удаления солей методами диализа или гельхроматографии. Высаливанием белков обычно пользуются в клинической практике при анализе белков сыворотки крови и других биологических жидкостей, а также в препаративной энзимологии для предварительного осаждения и удаления балластных белков или выделения исследуемого фермента. Различные белки высаливаются из растворов при разных концентрациях нейтральных растворов сульфата аммония. Поэтому метод нашел широкое применение в клинике для разделения глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении) и альбуминов (выпадают при 100% насыщении). [c.26]

Выделение белка. В аппарате Сокслета экстрагируют 50 г гороховой муки эфиром до полного удаления жира. Чтобы эфир испарился из обезжиренной муки, ее рассыпают тонким слоем на листе фильтровальной бумаги. Затем муку переносят в стакан, заливают 500 мл 10%-ного раствора хлористого натрия, тщательно перемешивают и оставляют на ночь в холодильнике при температуре не выше 4°. Вытяжку центрифугируют, прозрачный цент-рифу гат насыщают сульфатом аммония и оставляют на ночь в холодильнике. Выпавший осадок белков центрифугируют или отфильтровывают отсасыванием, суспендируют в воде и подвергают диализу для удаления солей и других низкомолекулярных примесей. [c.246]

М и, наконец, до 2,05 М позволяет фракционировать глобулин сыворотки на альфа-, бета-, и гамма-глобулины соответственно. Все отмеченные достоинства сульфата аммония и поныне широко используются многими исследователями на начальных стадиях очистки ряда белков, в особенности малоизученных и лабильных. Следует отметить, однако, общий недостаток всех солевых осадителей — трудность их удаления из полученного препарата. Для этого приходится прибегать либо к длительному диализу, либо к переосаждению другими методами. [c.17]

Для получения ферритина до сих пор широко используется метод Гранина [21], основанный на относительной устойчивости ферритина к нагреванию. Водный экстракт измельченной ткани нагревают до 80 °С на водяной бане. После охлаждения и удаления денатурированных белков ферритин осаждают сульфатом аммония и выделяют центрифугированием. Его можно очистить перекристаллизацией из 5%-ного раствора С(1504. Добавление С(1804 и последующий диализ при pH 4,6 иногда приводят к осаждению нерастворимого продукта. Это вещество и коричневый маточный раствор, окружающий кристаллы ферритина, иногда называют некристаллизующимся ферритином. Ферритин можно также получить, минуя стадию нагревания [22, 23], и перекристалли-зовать в присутствии различных ионов двухвалентных металлов [14]. [c.301]

Растворимость групповых веществ изменяется всякий раз, когда при их выделении используется переваривание белков. При этом часть, а иногда и все групповые вещества становятся растворимыми в феноле. В этом случае групповые вещества можно осадить в довольно мягких условиях 10%-ным этанолом [48]. После удаления фенола диализом дальнейшую очистку групповых веществ можно проводить с помощью фракционирования солями или органическими растворителями. Активные препараты, полученные из жидкости кисты яичника экстракцией 90%-ным фенолом, в большинстве случаев можно разделить на два компонента, из которых один не растворяется в насыщенном сульфате аммония при 60°, а другой полностью растворим [54]. Оба компонента обладают группоспецифической активностью, однако первый активнее второго, несмотря на то что оба препарата выделены из одной кисты. [c.170]

Обычно используется грубое фракционирование антисыворотки, приводящее к удалению альбумина. К сыворотке при 4 С медленно добавляют равный объем насыщенного холодного раствора сульфата аммония (pH доводят до 7 с помощью аммиака) и смесь далее перемешивают в течение 30 мин либо сыворотку диализуют при 4°С в течение ночи против 50 объемов сульфата аммония при 50%-ном насыщении. [c.209]

Высаливание. Иммуноглобулины и прежде всего IgG характеризуются наименьшей степенью гидратации среди белков сыворотки. Поэтому они прежде других белков выпадают в осадок при прибавлении к сыворотке солей, энергично связывающих воду и в силу этого разрушающих гидратную оболочку белковой молекулы. Так, при концентрации сульфата аммония 34—35% насыщения из сыворотки выпадает IgG, не содержащий практически примеси других белков. Наибольшей полноты осаждения можно достичь при значении pH 7,0—7,2, т. е. близком к изоэлектрической точке наименее заряженных молекул IgG. Осажденные сульфатом аммония иммуноглобулины обычно полностью растворяются после удаления соли диализом. Простота метода и возможность с его помощью значительно увеличить удельную концентрацию иммуноглобулинов в растворе делает его одним из наиболее популярных методов выделения иммуноглобулинов. [c.239]

Обессоливание растворов. С помощью колонки, заполненной сефадексом G-25, можно проводить обессоливание растворов высокомолекулярных соединений. Фракции высокомолекулярных соединений элюируются с внешним объемом колонки, в то время как фракции, содержащие низкомолекулярные соединения, распределяются между подвижной и неподвижной фазами и поэтому движутся с меньшей скоростью. Обессоливание — более быстрый и эффективный метод, чем диализ, и используется, в частности, для удаления фенола из растворов нуклеиновых кислот, сульфата аммония из растворов белков, а также для отделения моносахаридов от полисахаридов и аминокислот от белков. [c.100]

Белки, осажденные сульфатом аммония, почти не денатурируются после удаления соли из белкового осадка (диализом через целлофановую мембрану) его растворяют и используют для различных целей. На этом принципе основано приготовление некоторых видов концентрированных лечебных сывороток и нротивокоревого у-глобулина. [c.184]

Ионообменная хроматография. Колонку (40x2,5 см), заполненную КМ-целлюлозой (с. 109), уравновешивают 30 мМ К-фосфатным буфером, pH 6,0, содержащим 10 мМ 2-меркаптоэтанол. Пер1 д нанесением на колонку раствор белка диализуют против уравновешивающего буфера до полного удаления сульфата аммония. На колонку можно нанести до 500 мг белка. После нанесения белка колонку промывают уравновешивающим буфером (примерно 75 мл). Для элюции фермента используют линейный градиент концентрации КС1 от О до [c.272]

Асцитные жидкости центрифугируют при 50 ООО в течение 30 мин. Супернатант разбавляют в четыре раза холодным фосфатным буфером. Добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония при постоянном перемешивании и оставляют на 1 ч при 4°С. Центрифугируют при 5000 g в течение 10 мин. Осадок растворяют в буфере В и диализуют против буфера Б. Меняют буфер через 3—4 ч. Диализуют не менее 8 ч. Центрифугируют при 15000 g в течение 10 мин для удаления денатурированных белков. Измеряют экстинкцию при 280 нм предварительно разбавленного в 100 раз раствора и по формуле ( 280 1,25) рассчитывают содержание белка в миллиграммах (асцитн ле жидкости содержат обычно 25—35 мг/мл белка). [c.316]

Полученный столь простым способом технический препарат, помимо разнообразных возможностей его технического применения, оказался удобным для дальнейшей, в том числе высокой, очистки. Из разработанных способов заслуживает наибольшего внимания кристаллизация. Технология проведения ее следующая а) растворение технического препарата в семикратном количестве воды (5+2 объема), причем нерастворившаяся часть отбрасывается б) введение в раствор сухого сульфата аммония из расчета около 600 г соли на 1 л раствора в) кристаллизация белка, протекающая 40—48 ч при комнатной температуре г) центрифугирование кристаллического осадка, растворение его д) диализ против 0,0005 МСаСЬ для удаления сульфата аммония и стабилизации фермента е) лиофильное высушивание. [c.209]

Если церулоплазмин подкислить до pH ниже, чем его изоэлектрическая точка, или обработать цианидом [42], из него можно удалить медь и получить бесцветный белок. Однако при добавлении к такому белку ионов меди реставрировать исходный фермент не удается. Обратимое удаление меди из церулоплазмина достигается при обработке его диэтилдитиокарбаматом (ДТК) [43]. Предварительно медь (И), содержащаяся в белке, восстанавливается цистеином при pH 5,0 и высокой ионной силе. Образующийся затем коллоидальный комплекс ДТК с вышедшей из белка медью с помощью ультрацентрифуги отделяют от раствора апофермента. Последний может быть очищен от всплывающих примесей путем осаждения сульфатом аммония, повторного растворения и диализа. В замороженных растворах апофермент устойчив в течение нескольких месяцев. При добавлении к такому апоферменту ионов меди(1) и реокисления на воздухе из него можжо вновь получить синий церулоплазмин, который по всем своим свойствам неотличим от исходного. В процессе перевода церулоплазмина в его апофермент и обратно не было обнаружено никаких форм, в которых содержание меди было бы промежуточным, т. е. отличным от содержания ее в апоферменте и холоферменте [44]. [c.368]

Препарат куриного пепсиногена получали из слизистой желудка. Измельченную в мясорубке ткань экстрагировали четырехкратным объемом 9%-ного раствора сульфата аммония, приготовленном на 0,1 М бикарбонате натрия. Для удаления слизистых веществ экстракт, к которому предварительно добавляли К2НРО4 до концентрации 0,2 М, смешивали с равным объемом суспензии гидроокиси меди, а затем фильтровали. Избыток ионов меди в фильтрате связывали верзеном. Пепсиноген осаждали сульфатом аммония при доведении концентрации до 35 %. Осадок пепсиногена перед хроматографированием растворяли и диализовали против [c.275]

Осаждаемый сульфатом аммония белок собирают центрифугированием (1200 g в течение 20 мин при 4°С), растворяют в ФСБ-А и три раза диализуют против 50-кратного объема ФСБ-А для удаления сульфата аммония. Подробности очистки и характеристики сывороток приведены в вышеупомянутой монографии Клаузена ( lausen, 1969). [c.209]

Очищенный препарат иммуноглобулина диализуют против 0,1 М ацетатного буфера с pH 4,3, затем к нему добавляют кристаллический пепсин 1 в соотношении глобулин пепсин 50 1 и, если необходимо, доводят pH до 4,3 1 М уксусной кислотой. Смесь оставляют на водяной бане при 37°С на 8—14 ч, затем охлаждают во льду. Осадок, который может образоваться во время реакции, удаляют центрифугированием и доводят pH до 8,0 с помощью 1 М NaOH при этом значении pH пепсин инактивируется. Чтобы удалить мелкие пептиды, ферментированный иммуноглобулин диализуют против большого объема ЗФР или добавляют сульфат аммония до конечной концентрации 2,4 М, центрифугируют 30 мин при 5000g, осадок растворяют в ЗФР и раствор диализуют для удаления ионов сульфата. Чистоту готового препарата проверяют с помощью иммунодиффузин в агаровом геле (если имеются сыворотки анти-РаЬ и анти-F ) или более чувствительным методом электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН (см, гл. 4), сопоставляя интактный, восстановленный и алкилированный образцы. Если ферментолиз прошел не полностью [c.167]

К полученному экстракту при 4°С медленно добавляют сухой сульфат аммония (перекристаллизованный) до насыщения 0,7 [из расчета 44 г (МН4)г504 на 100 мл экстракта] . Осадок, сформировавшийся на холоду в течение ночи, отделяют центрифугированием на ЦВР в течение 40 мин при 28000 д, суспендируют в минимальном объеме охлажденного раствора А и диализуют сначала против дистиллированной воды, а затем против раствору А до полного удаления следов сульфата аммония и глюкозы. Об -отсутствии в диализованном препарате фермента сульфата аммония и глюкозы судят по отрицательной реакции с реактивом Несслера и с глюкозооксидазным реактивом, соответственно. [c.107]

М МаС для уменьшения электростатических взаимодействий между белками и амфолитами. Полное освобождение от амфолитов путем обычного диализа требует длительного времени (около 32 ч). Его можно значительно сократить, если есть возможность воспользоваться диализом в биофибрах или ультрадиализом под давлением в ячейках типа Ат1соп . Если очищенные белки выдерживают осаждение сульфатом аммония, то этот способ очистки следует предпочесть как более быстрый. Амфолиты не выпадают в осадок даже из насыщенного раствора сульфата аммония. Для полного удаления амфолитов осадок белка следует трижды промыть таким же раствором сульфата аммония и лишь после этого растворять в буфере. Гель-фильтра- [c.65]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология