Фермент-зависимые метки ФЗМ

Фермент-зависимые метки [c.11]

Фермент-зависимые метки (ФЗМ)—это вещества, которые можно количественно определять с помощью ферментативных реакций. К ФЗМ относятся субстраты, кофакторы, простетические группы, модуляторы ферментов (т. е. ингибиторы или активаторы), фрагменты ферментов, апоферменты и ферменты. [c.11]

Приготовление вытяжки пероксидазы. 2—4 г растительного материала (в зависимости от ожидаемой активности фермента) тщательно растирают с чистым песком, не содержащим соединений железа, или битым стеклом. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу емкостью 200 мл, доводят водой до метки, взбалтывают и настаивают 2 ч, а затем фильтруют. Фильтрат служит для определения активности. Активность пероксидазы можно также определять непосредственно в болтушке, не фильтруя ее. [c.108]

Основные кинетические закономерности протекания ферментативных реакций. В иммуноферментных методах анализа в качестве метки антигенов и антител могут использоваться как ферменты, так и их субстраты. Если меткой служит молекула фермента, то выбранный способ детекции должен обеспечивать регистрацию сигнала, пропорционально зависимого от концентрации (количества) фермента, а в случае применения в качестве метки субстрата — концентрации (количества) субстрата. В первом случае фермент выполняет роль маркера (он ковалентно связан с молекулой антигена или антитела), во втором — детектора (свободный фермент). Оптимизация условий каталитической реакции (выбор pH, оптимальных концентраций фермента и субстратов) осуществляется в соответствии с используемой модификацией ИФА. [c.61]

В зависимости от структуры и молекулярной массы антигена при введении ферментной метки его константа связывания с антителами может увеличиваться, уменьшаться или оставаться неизменной. Увеличение эффективного значения константы связывания может быть обусловлено образованием в результате химической модификации олигомеров меченого антигена, формирующих при взаимодействии с антителами сложные по составу комплексы. Уменьшение сродства молсет наблюдаться при экранировании ферментом части антигенных детерминант либо в результате кон-формационных изменений, возникающих из-за образования ковалентных связей. [c.230]

Чувствительность иммуноанализа зависит от констант связывания специфических антител. Чем больше константа связывания, тем чувствительнее система (Yalow, 1980). Помимо антител с высокой константой связывания для создания удобнога метода анализа необходима чувствительная метка, облегчающая детектирование. Фермент-зависимые метки, как правило, очень чувствительны, так как они усиливают слабые сигналы благодаря катализу. Удалось, например, определить даже отдельную молекулу фермента -галактозидазы (Rotman, 1961). [c.31]

Фермент-зависимые метки (ФЗМ) — универсальные и чувствительные метки для иммуноанализа. Они отличаются продолжительным периодом полуинактивации, не создают радиационной опасности и позволяют проводить, иммуноферментный анализ (ИФА) без разделения компонентов (гомогенный анализ). ИФА без разделения требует меньше манипуляций и легче поддается автоматизации. Однако на нынешнем этапе своего развития этот метод недостаточно чувствителен. В то же время ИФА с разделением компонентов (гетерогенный анализ) обладает высокой чувствительностью и дает возможность определять два различных вещества одновременно. Превосходным примером высокой чувствительности ИФА с разделением компонентов служит метод определения ферритина, позволяющий измерять 0,2 аттомоль, т. е. 2-10 моль вещества (Ishikawa et al., 1982). [c.32]

Одна из интересных реакций с участием витамина В12 — этО классическая органическая реакция превращения 1,2-пропандио-ла в пропионовый альдегид [10]. Обычно она осуществляется при воздействии серной кислоты, однако при использовании витамин В12-зависимого фермента ее удается провести в мягких условиях. Для этой окислительно-восстановительной реакции, протекающей по внутримолекулярному механизму, присутствие витамина В12 совершенно необходимо, поскольку при его удалении путем обработки активированным углем фермент теряет активность, но полностью восстанавливает ее при последующем добавлении новой порции витамина В12. При окислении d,l-, 2-пропандиола-1-/ в пропионовый альдегид в присутствии кобала-мин-зависимого фермента диолдегидратазы атом трития переносится на молекулу кофермента, причем тритиевая метка попадает исключительно в положение С-5 аденозильного остатка На этом основании можно предложить следующий механизм [c.196]

Одним из первых фактов, выяснение которых позволяло прийти к определенным заключениям о строении активного центра ферментов, было открытие, что диизопронилфторфосфат ДФФ) подавляет активность химотрипсина, причем подавление активности находится в стехиометрической зависимости от количества добавленного ДФФ, и что при использовании ДФФ, меченного метка включается в химотрипсин 116]. С тех пор биохимики значительно продвинулись вперед в решении этой проблемы. В настоящее время известно, что ДФФ вступает во взаимодействие с многими [c.107]

На рис. 4 показаны зависимость концентрации тиллама от времени и кинетика накопления продуктов разложения, из которых особенно быстро накапливаются соединения, растворимые в спирте. В нерастворимые в спирте компоненты растения и в СОз метка включалась в незначительной степени это говорит о том, что молодые растения маш-фасоли не обладают достаточно эффективными окислительными системами ферментов. Тем не менее ка-таболическое окисление тиллама под действием тканей корней и стеблей с образованием СОг протекало значительно быстрее (рис. 5). В опытах in vitro ткани корней и стеблей выделяли от 18,3 до 39,6 7о метки в виде углекислого газа (табл. 3). [c.154]

Смесь субстратов для определения аланинаминотрансферазы. Растворяют 29,2 мг а-кетоглютаровой кислоты и 1,78 г а-аланина (d, 1) в 10 мл буфера, определяют pH (7,4) и при наличии зеленого окрашивания осторожно, по каплям, прибавляют 1 н. раствор едкого натра. Проверив pH, переносят раствор в мерную колбу емкостью 100 мл и доводят до метки буфером. Субстратные смеси необходимо готовить в день исследования активности ферментов и только в крайнем случае, при отсутствии помутнения, ими можно пользоваться на следующий день, сохраняя в холодильнике при 4°. Целесообразней в зависимости от потребности готовить субстратные смеси в объеме 10, 25 и 50 мл. [c.85]

Авидин и стрептавидин в качестве меченых зондов. Принципиальная схша этого метода представлена на рис. 5.3. Исследуемый образец инкубировали с высокоаффинными моноклональными антителами, ковалентно связанными с полистирольными шариками диаметром 6,5 мм [19 ]. Затем в систему вводили биоти-нилированные антитела к другим эпитопам антигена. По завершении иммунологической реакции добавляли авидин, меченный ферментом, или содержащий хемилюминесцентную метку стрептавидин. В зависимости от используемого маркера измерение осуществляли спектрофотометрически или по интенсивности люминесценции. [c.68]

Протеолиз играет особенно важную роль в процессах клеточной дифференцировки, о чем, например, свидетельствует утрата способности к спорообразованию при дефекте синтеза протеиназ. Возможны два основных типа протеолиза ЛТР-независимый и АТР-зависимый. Первый активируется в условиях голодания и не требует затраты энергии второй действует постоянно и весьма избирательно. В эти системы, вероятно, включаются разные ферменты, так как некоторые ингибиторы протеиназ подавляют первый процесс и не влияют на второй. АТР-зависимый протеолиз, по-видимому, включает стадию узнавания аномального белка и введение в него метки, которой является специальный белковый агент — убихитин, после чего меченый белок подвергается деградации протеиназами. [c.91]

Все эти свойства в совокупности являются тестом на выяв-ние аффинной метки, модифицирующей в активном центре группу, ионизация которой контролирует активность фермента. Наличие кинетики с насыщением (п. г) показывает, что метка образует комплекс с ферментом, хотя это можно и не обнаружить, если /С] лежит в области концентраций, при которых ингибитор не растворяется. Конкурентное ингибирование субстратом (п. а) подтверждает, что связывание происходит в активном центре. Стехиометрическое соотношение 1 1 означает, что эта модификация является избирательной. Ценные данные позволяет получить анализ рН-зависимости различных параметров. Как отме- [c.246]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология