Химотрипсин активный центр

Рис. 9. Строение активного центра а-химотрипсина по Блоу с сотр. [29]. [Боковая группа субстрата — Ы-формил-А-триптофан (выделен жирно) расположена в гидрофобной полости активного центра]

Таким образом, и механизм каталитического действия, и специфичность к субстрату ферментов можно объяснить свертыванием их полипептидной цепи и положением на ней радикалов. Характер свертывания белковой цепи в трипсине показан на рис. 21-20. Этот фермент построен из одной непрерывной полипептидной цепи, включающей 223 аминокислоты. (В нумерацию аминокислот на рисунке внесены изменения-пропуски и вставки, чтобы привести ее в соответствие с нумерацией в химотрипсине и эластазе.) Молекула трипсина имеет приблизительно сферическую форму диаметром 45 А и чашевидное углубление с одной стороны для активного центра. На рис. 21-20 атомы аспарагиновой кислоты, гистидина и серина в активном центре изображены черными кружками. Подлежащая разрыву белковая цепь изображена цветными кружками с черными ободками, а стрелка указывает положение разрываемой связи. Жирные штриховые синие линии с двух концов субстрата указывают, что его цепь растягивается на значительную длину в обоих направлениях. Карман специфичности для радикала R изображен точечными синими линиями в правой нижней части рисунка, и поскольку иллюстрируемой молекулой является трипсин, в карман вставлена аргининовая боковая цепь, притягиваемая отрицательным зарядом аспарагиновой кислоты 189 в нижней части кармана. [c.323]

Рис. 31. Расположение аминокислотных остатков в каталитическом участке активного центра химотрипсина по рентгеноструктурным данным [37]

С другой стороны, эти ферменты сильно различаются по специфичности их действия. Так, сериновые протеазы а-химотрипсин и эластаза осуществляют гидролиз пептидной связи, образованной аминокислотой, содержащей в положении гидрофобную боковую группу R при этом специфичность а-химотрипсина определяется объемным гидрофобным радикалом в молекуле субстрата (типа боковой группы фенилаланина, триптофана), а для эластазы — метильной группой аланина. Механизм наблюдаемой специфичности обусловлен весьма незначительными различиями в строении активных центров этих двух ферментов. По данным рентгеноструктурного анализа, в активном центре а-химотрипсина имеется довольно вместительный гидрофобный карман , где связывается ароматическая боковая группа гидролизуемого пептида (рис. И, а ср. с рис. 9). В активном центре эластазы размеры сорбционной области, где происходит связывание метильной группы субстрата (рис. 11, б), намного меньше, чем в случае а-химотрипсина. Это вызвано тем, что вместо Gly-216 и Ser-217 см. рис. 9) в соответствующих положениях эластазной пептидной цепи расположены более объемные остатки треонина и валина [3]. [c.35]

Среда активного центра отличается, как правило, сильно развитой микрогетерогенностью. Это связано с тем, что в образовании поверхностного слоя белков принимают участие не только заряженные и полярные аминокислотные остатки (которым, поскольку они сильно сольватированы, термодинамически выгодно контактировать с водой), но также частично и аполярные (углеводородные) боковые группы. Так, например, для а-химотрипсина методом рентгеноструктурного анализа [c.20]

На стадии ацилирования происходит нуклеофильная атака карбонильного углерода субстрата обобщенным нуклеофилом активного центра 8ег-195... Н1з-57... Азр-102. В результате ацилирования активного центра происходит поворот остатка 8ег-195 вокруг С —Ср-связей, что сопровождается перемещением атома кислорода на- 2,5А. При этом имидазольная группа Н1з-57 перемещается в сторону растворителя [18]. В результате имидазольная группа Н13-57, будучи включенной в свободном ферменте (и, по-видимому, в комплексе Михаэлиса) в водородную связь с 8ег-195 (рис. 31), в ацилферменте предоставляет свой М атом для образования водородной связи с водой (рис. 32). В итоге активированная молекула воды приобретает способность эффективно атаковать карбонильный- углерод субстрата на стадии деацилирования. При этом образуется кислотный продукт гидролиза и регенерируется свободный фермент. Таков в общих чертах химический механизм гидролитического действия химотрипсина. [c.131]

Взаимодействие пептидного субстрата с сериновой протеазой (а-химотрипсин), активный центр которой состоит из пространственно разделенных сорбционного и каталитического участков (по И. В. Березину, К. Мартинеку, 1977) [c.431]

Вообще говоря, существуют еще три уровня специфического узнавания субстратов в ферментативном катализе. Давайте рассмотрим пептидную связь в полипептидной цепи. Боковая цепь Рг определяет нормальную специфичность фермента. Для а-химотрипсина Нг — это ароматическая боковая цепь, а гидрофобная полость (ароматическая щель) в активном центре предназначена для взаимодействия с аминокислотой, узнаваемой ферментом. Такую избирательность называют первичной структурной специфичностью. [c.235]

Химический механизм реакций гидролиза, катализируемых химотрипсином. При гидролизе молекулы субстрата, сорбированной на активном центре, в роли атакующего нуклеофила выступает ОН-группа 5ег-195 [2, 6—9, 32]. Химика-органика, малознакомого со спецификой реакций, протекающих с участием белков, могло бы насторожить то, что нуклеофильность гидроксила серина в модельных низкомолекулярных соединениях низка, поскольку при физиологических значениях pH 7—8 группа ОН слабо ионизована (рКа 13,6) [33, 34]. В связи с этим укажем, что исключительно высокая активность 8ег-195 связана именно с его окружением в активном центре. Так, в среде 8 М мочевины (при денатурации белка) он теряет свои уникальные свойства [35, 36]. [c.129]

Влияние среды на гидрофобное взаимодействие активного центра химотрипсина с субстратами и ингибиторами. Исследование эффектов среды — это классический подход к изучению природы комплексообразования. В-приложении к химотрипсину результаты таких исследований подтвердили гидрофобный характер фермент-субстратных взаимодействий. [c.143]

В качестве примера сравним характеристики комплексообразования с активным центром а-химотрипсина двух красителей [61], а именно профлавина [c.30]

Много попыток было сделано по созданию модели системы с эстафетной передачей заряда , которая функционирует в активном центре а-химотрипсина (а возможно, и других сериновых протеаз) [c.100]

Представление об активном центре химотрипсина как структуре, состоящей из пространственно и функционально разделенных участков (сорбционного и каталитического), в литературе сложилось раньше [102], чем появились рентгеновские данные о структуре кристаллического фермента. В этом сыграли важную роль исследования механизма действия ряда ингибиторов [16]. Использованные подходы могут оказаться весьма полезными при изучении структуры и функций активного центра Других ферментов. [c.147]

Многостадийный характер превращения субстрата на активном центре химотрипсина [6—101. Гидролиз субстратов (сложных эфиров,. амидов) на активном центре химотрипсина протекает в несколько стадий. На первой стадии ферментативного процесса происходит сорбция субстрата (образование комплекса Михаэлиса Е5). На последующих стадиях наблюдается химическое превращение сорбированной молекулы с промежуточным образованием ацилфермента ЕА. В кинетической схеме [c.128]

С другой стороны, константа диссоциации фермент-субстратного комплекса Ks сохраняет постоянное значение при кислых и нейтральных значениях pH, но с дальнейшим увеличением pH она возрастает [13, 46]. Последнее объясняют тем, что правильная стереохимическая конформация активного центра обусловлена взаимодействием ионной пары (Asp-194)—СОО . .. " NHa — (11е-16), находящейся внутри ферментной глобулы (См. рис. 31). В результате депротонизации а-аминогруппы Пе-16 (с рКа — 8,5—9) происходит разрушение солевого мостика , что приводит к потере ферментом сорбционной способности. Это представление согласуется с данными рентгеновского анализа структуры кристаллического химотрипсина [17], однако ван<ность именно а-аминогруппы Пе-16 для катализа поставлена под сомнение в ряде работ ]47, 48]< [c.132]

Рис. 33. Стереоспецифическое связывание молекулы субстрата на активном центре химотрипсина

Гидрофобная область активного центра химотрипсина [c.138]

Константы равновесия в том и другом случае отличаются незначительно (в 2—4 раза). В то же время при переходе от профлавина к родамину 6Q процесс комплексообразования красителя с активным центром замедляется почти в 10 paat Структуры молекул этих лигандов различаются в основном лишь тем, что молекула родамина 6Q содержит дополнительное бензольное кольцо. Как показало изучение температурной зависимости кинетики комплексообразования, энергия активации этого процесса порядка 17 ккал/моль (71,4 кДж/моль). С другой, стороны, известна, что энергия активации процессов, контролируемых диффузией, не превышает, как правило, 5 ккал/моль (21 кДж/моль) [62, 63]. Поэтому следует заключить, что образование комплекса химотрипсина с более объемной молекулой родамина 6G возможно лишь в результате конформационных изменений в молекуле фермента. Такой механизм (1.8) комплексообразования органических молекул с белками, по-видимому, весьма распространен. [c.31]

При исследовании строения и функций активного центра химотрипсина оказался плодотворным хорошо зарекомендовавший себя в гомогенном и гетерогенном катализе метод, устанавливающий взаимосвязь между структурой молекулы субстрата и его реакционной способно- [c.147]

В целом микросреда поверхностного слоя обладает, как правило, более низкой диэлектрической проницаемостью (присущей органическим растворителям) по сравнению с водой [23]. Так, значение диэлектрической проницаемости в сорбционном участке активного центра химотрипсина меньше 10 (для воды е = 80 в бутаноле в = 8 в октане е = 2) [c.21]

Правила структурной организации глобулярных белков рассмотрены Шульцем [81]. Согласно им, в структ фе таких белков следует выделять большее число уровней организации. Иерархия берет свое начало от аминокислотной последовательности. Затем следует вторичная структура с регулярной укладкой полипептидной цепи, характеризующейся максимальным образованием водородных связей. Вторичная структура может образовывать до 75% всей полипептидной цепи. Иногда в молекуле белка можно выделить агрегаты вторичной структуры (сверхвторичная структура), являющиеся регулярными образованиями из нескольких участков полипеп-тидных цепей, например двойная а-спираль или складчатый лист-спираль. Пример более высокой ступени организации глобулярных белков — образование доменов. Они возникают у крупных белков и характеризуются как независимые пространственные структуры. Иммуноглобулины, например, образуют при соответствующем сворачивании полнпептидных цепей от 2 до 4 доменов. В химотрипсине активный центр находится внутри, между двумя доменами. В данном случае домены имеют структуру складчатого листа-цилиндра и связаны один с другим лишь одной полипептидной цепью. И наконец, глобулярные белки, построенные из нескольких доменов, могут упаковываться в еще более крупные структурные образования. Возникающие при этом агрегаты обычно построены симметрично, причем структура входящих в их состав мономеров, вероятно, не меняется. [c.364]

Одним из наиболее исследованных семейств ферментов являются сери-нопротеазы. Все они предназначены для расщепления полипептидньгх цепей белков по механизму, в котором участвует боковая цепь аминокислоты серина (— Hj—ОН), находящейся в активном центре фермента. Три такие протеазы (трипсин, эластаза и химотрипсин) синтезируются в поджелудочной железе и вьщеляются ею в кишечник, где они превращают содержащиеся в пище белки в аминокислоты, способные всасываться через стенки кишечника. Благодаря возможности легко изолировать эти ферменты и их сравнительно высокой устойчивости их удалось интенсивно исследовать химическими способами еще до того, как стало возможным проведение рентгеноструктурного анализа белков. В настоящее время биохимический и рентгеноструктурный анализы позволили установить достаточно ясную картину функции этих ферментов, иллюстрирующую два аспекта действия любых ферментов каталитический механизм и специфичность к субстрату. [c.318]

Трипсин, химотрипсин и эластаза-три родственных фермента, обладающих одинаковым каталитическим механизмом, но имеющих различную избирательность к субстрату. Они воздействуют на белковую цепь субстрата, образуя ацильный промежуточный продукт между сериновым радикалом фермента и фрагментом цепи субстрата, а затем отщепляют этот фрагмент цепи с молекулой воды. Избирательность этих ферментов определяется наличием на их поверхности по соседству с активным центром кармана , в который вставляется один из радикалов субстрата, подходящий по размеру. [c.339]

Один из возможных путей для получения ответа на поставленные вопросы, вероятно, состоит в использовапии простых модельных субстратов фермента а-химотрипсипа. С этой целью Хейн и Ниман [101] впервые попытались выяснить конформацию некоторых субстратов, присоедипенных к а-химотрипсину, используя молекулы с фиксированной конформацией, для моделирования конформации, которую принимает в активном центре типичный ациклический субстрат метиловый эфир Н-ацетил-ь-фенилаланина (ь-АРМЕ). Для этого Ниман изучал кинетические свойства о- и ь-1-кето-3-карбометокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина (КСТ1). Это [c.233]

Не менее поучительно сопоставление сорбционных функций а-химотрипсина и другой сериновой протеазы — трипсина. Размеры и форма субстратсвязывающего (сорбционного) участка в активных центрах обоих ферментов примерно одинаковы [3]. Единственное различие в первичной структуре полипептидных фрагментов, образующих гидрофобный карман , состоит в том, что в а-химотрипсине остаток 189 — это серин (см. рис. 9), а в трипсине в соответствующем положении находится отрицательно заряженная аспарагиновая кислота. Это приводит к тому, что в отличие от а-химотрипсина трипсин обнаруживает специфичность к гидролизу пептидных связей, образованных положительно заряженной аминокислотой (Lys, Arg). Сорбция положительно заряженного субстрата на ферменте (вблизи каталитически активного нуклеофила активного центра) происходит в данном случае за счет электростатических взаимодействий (рис. И, б). [c.35]

Наиболее важная информация о строении молекулы химотрипсина (молекулярная масса 25 ООО) была получена с помощью рентгеност-зуктурных исследований последних лет, проведенных Блоу с сотр. 14, 17—19]. Как итог своих исследований авторы представили трехмерную модель молекулы химотрипсина (см. рис. 3). В согласии с ранними общими представлениями о строении белков было найдено, что все заряженные группы в молекуле этого фермента направлены в сторону водного растворителя (за исключением трех, которые выполняют специфические функции либо в механизме активации зимогена, либо в механизме действия активного центра). Особенности расположения аминокислотных остатков с гидрофобными боковыми цепями внутри белковой глобулы также согласуются с ранними представлениями о важной роли гидрофобных взаимодействий в стабилизации третичной структуры белков (см. гл. I). [c.127]

Рентгеновские исследования комплексов химотрипсина с субстратоподобными ингибиторами сыграли принципиальную роль в установлении структурных предпосылок каталитической функции его активного центра (см. 2 этой главы). Однако для выяснения динамических аспектов действия активного центра оказались особенно плодотворными подходы химической кинетики (см. 5,6 этой главы). Успехи кинетических исследований были во многом предопределены открытием М. Бергмана и Д. Фрутона и позднее Г. Нейрата и их сотрудников, которые установили, что химотрипсин способен гидролизовать не только сложные белковые молекулы, но также и простые низкомолекулярные синтетические субстраты (амиды, сложные эфиры и др.) [20]. [c.127]

Константы равновесия при образовании комплекса с активным центром химотрипсина производных Ы-ацетил-1-тирозина H0 aH4 H2 H(NH 0 Hз) (0)X [c.133]

Для объяснения этих фактов активный центр химотрипсина представляют обычно (в развитие идей школы Нимэнна [55, 64]) состоящим из участков, комплементарных по отношению к отдельным фрагментам молекулы специфического субстрата [7, 59, 65]. Движущая сила сорбции фрагмента К на ферменте — это гидрофобное взаимодействие. Фактически образование комплекса фермент — субстрат обусловлено тем, что боковая гидрофобная субстратная группа подвергается термодинамически выгодной экстракции из воды в органическую среду белка (см. 4—6 этой главы). Молекулярная модель активного центра была предложена Блоу с сотр. [66] на основании результатов рентгеноструктурного анализа кристаллического химотрипсина (см. рис. 9). Размеры гидрофобной полости в районе активного центра составляют (10—12) х(5,5—6,5)Х(3,5—4) А. Эти размеры достаточны, чтобы вместить боковую цепь триптофана или тирозина, но вместе с тем форма полости делает возможной только лишь одну, строго определенную ориентацию плоскости ароматического кольца. [c.134]

Глобула химотрипсина содержит лишь один комплексующий центр, способный быстро и обратимо сорбировать углеводородные молекулы, — это активный центр фермента [73]. Гипотеза о существовании гидрофобной области в активном центре химотрипсина была выдвинута в начале 60-х годов на основании исследования ингибирующих свойств большого числа производных бензола, нафталина и других ароматических соединений [74—76]. Эта гипотеза находит подтверждение в том, что связывание с активным центром некоторых конкурентных ингибиторов, содержащих хромофорные группы, приводит к сдвигу их спектра в длиннойолновую область [77—79]. Анализируя величину спектрального сдвига, Кэллос и Эвейтис [80] пришли к выводу, что активный центр фермента по величине диэлектрической постоян- [c.138]

Это интересное явление еще не нашло достоверной физико-химической трактовки. Можно лишь полагать, что причины его заложены в том, что сложноорганизованный (микрогетерогенный) и относительно жесткий сорбционный участок активного центра в отличие от жидких экстракционно-адсорбционных моделей представляет собой (если рассматривать это явление в высшей степени формально) как бы щипцы , которые в результате гидрофобных взаимодействий ухватывают в молекуле ингибитора лишь ее гидрофобный остов, центральной группой которого является плоское ароматическое ядро. Эта гипотеза находит отражение в молекулярной модели активного центра, предложенной Блоу с сотр. [66] на основании результатов рентгеноструктурного анализа кристаллического химотрипсина (см. рис. 9). Как уже отмечалось, форма полости делает возможной лишь одну, строго определенную ориентацию плоскости ароматического кольца. [c.141]

Алифатические обратимые конкурентные ингибиторы. Как видно из рис. 37, сррбционный участок активного центра малоспецифичен по отношению к структуре алифатической цепи в молекуле ингибитора (алканолы). Независимо от того, является ли алифатическая цепь нормальной или разветвленной, эффективность обратимого связывания алканола КОН на активном центре определяется валовой гидрофобностью группы К. А именно, величина lg i, характеризующая прочность комплекса, возрастает линейно (с наклоном, близким к единице) со степенью распределения 1 Р этих соединений между водой и стандартной органической фазой (н-октанол). Наблюдаемая при этом величина инкремента свободной энергии переноса СНа-группы из воды в среду активного центра равна приблизительно —700 кал/моль (2,9 кДж/моль) (для низших членов гомологического ряда). Эта величина близка к значению инкремента свободной энергии, которое следует из известного в коллоидной химии правила Дюкло—Траубе [90—92] и характерна для свободной энергии перехода жидкой СНа-группы из воды в неводную (гидрофобную) среду [85]. Все это позволяет рассматривать гидрофобную область активного центра химотрипсина как каплю органического растворителя, расположенную в поверхностном слое белковой глобулы. Эта капля либо адсорбирует гидрофобный ингибитор из воды на поверхность раздела фаз, либо, будучи расположенной несколько углубленно, полностью экстрагирует его. С точки зрения микроскопической структуры гидрофобной области правильнее было бы рассматривать ее как фрагмент мицеллы, однако такая детализация представляется излишней, поскольку известно, что свободная энергия перехода н-алканов из воды в микроскопическую среду мицеллы додецилсульфата слабо отличается от свободной энергии выхода тех же соединений из воды в макроскопическую жидкую неполярную фазу [93].. [c.142]

Солевой эффект при образовании комплекса активного центра с метилгидроциннаматом. Солевые эффекты, наблюдаемые при образовании комплекса Михаэлиса, довольно слабые [76], и поэтому достаточно обоснованное обсуждение их природы может быть дано лишь при использовании ряда солей. Результаты такого исследования, выполненного в приложении к образованию комплекса химотрипсина с метилгидроциннаматом [98], даны на рис. 39. Прежде чем анализировать эти данные, напомним, что термодинамику процессов образования комплекса Михаэлиса в воде и, соответственно, в водном растворе, содержащем третий компонент (соль, органический растворитель и т. п.) [c.143]

Рнс. 39. Влияние концентрации и природы соли на константу диссоциации Кз комплекса метилгидроциннамата с активным центром химотрипсина (а) и на коэффициенты активности / неэлектролитов (б) [98] [c.144]

З-образный характер зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в катализе химотрипсином. Изменение среды в результате добавки органических соединений также оказывает заметное влияние на эффективность сорбции на активном центре химотрипсина гидрофобных компонентов реакции. Причина этого заключается, как правило, в том, что органическая добавка, повышая растворимость субстрата (или субстратоподобного ингибитора) в воде, удерживает его в водном растворе и затрудняет тем самым [c.145]

Поскольку специфическое взаимодействие углеводородных субстратных фрагментов с активным центром химотрипсина гидрофобно (см. 2 и 4 этой главы), то специфический член S в уравнении (4.25) разумно представить в виде функции от показателя гидрофобности заместителя R. Таким параметром может служить константа я по Ганшу [105, 106], где я = IgP величина Р — это парциальный коэффициент распределения группы R между водой стандартным органическим растворителем (н-октанол) [см. уравнение (4.11)]. [c.149]

Те же закономерности характеризуют также и кинетику гидролиза химотрипсином специфических аминокислотных субстратов как на стадии ацилирования, так деацилирования [21, 113]. Пространственное взаимоотношение сорбционной и каталитической областей в активном центре нашло отражение также и в эффективности комплексообразования с химотрипсином бифункциональных ингибиторов, алкил- и фенилалкилборных кислот [114, 115]. [c.150]

Эти результаты (см. рис. 42) интересно сопоставить с данными по структуре кристаллического химотрипсина.. Согласно Стейтцу и др. [66], гидрофобная полость в кристаллическом ферменте (см. рис. 9) действительно узка (3,5—4 A) и длина ее не превышает 10 A. Таким образом, рентгеновские исследования структуры кристаллического фермента [66] и кинетические исследования его субстратной специфичности в водном растворе [21] привели к взаимно согласующимся данным о геометрии активного центра химотрипсина. [c.150]

Гидрофобное фермент-субстратное взаимодействие вносит важный вклад в специфичность химотрипсинового катализа (см. 2, 4, 5 этой главы). Это связано с тем, что составной нукЛеофил, входящий в активный центр фермента и принимающий участие в атаке сорбированной молекулы субстрата, расположен в поверхностном слое белковой глобулы [17—19, 66, 67]. Реакции, катализируемые химотрипсином, протекают таким образом вблизи поверхности раздела фаз вода — белок и сопровождаются термодинамически выгодным переносом (полным или частичным) гидрофобных фрагментов молекулы субстрата из одной среды (вода) в другую (белок). Свсбодная энергия такого рода гидрофобного взаимодействия, сопровождающего химическую реакцию между ферментом и субстратом, зависит от структуры субстрата, а также от геометрической конгруэнтности ее по отношению к активному центру (см. 5 этой главы). [c.150]

В согласии с механизмом (4.40) субстратоподобный ингибитор действительно вытесняет из активного центра несколько молекул воды, как это было обнаружено при рентгеноструктурном анализе кристаллического химотрипсина [123]. Однако этот механизм не согласуется с данными по влиянию среды на гидрофобное фермент-субстратное взаимодействие (см. 4 этой главы). Кроме того, механизм (4.40) противоречит тому, что двойной выигрыш свободной энергии экстракции реализуется лишь в переходном состоянии химической реакции [см. уравнение (4.39)], в то время как в комплексе Михаэлиса вклад гидрофобного фермент-субстратного взаимодействия меньше [см. уравнение (4.29)]. Иными словами, в химотрипсиновом катализе не вся потенциальная свободная энергия сорбции, которую предполагает модель (4.40), равная 2АСэкстр, реализуется в виде прочного связывания субстрата с ферментом. Из диаграммы, представленной на рис. 44, видно, что в комплексе Михаэлиса (или ацилферменте) реализуется в виде свободной энергии связывания E-R лишь инкремент свободной энергии сорбции, отражающий перенос субстрата из воды в неводное окружение (в среду белковой глобулы), равный АО кстр [см. также уравнение (4.29)]. Для объяснения этих фактов следует допустить, что гидрофобное фермент-субстратное взаимодействие идет в две стадии 1) образование фермент-субстратного комплекса протекает по механизму (4.19), который не противоречит данным по солевому эффекту (на их основании он был и предложен), и термодинамические закономерности его согласуются с уравнением (4.29). Этот механизм также предполагает вытеснение нескольких молекул воды из [c.155]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология