Концевая метка концевое мечение

Эта метка является хромофорной группой благодаря наличию в ней протяжённой системы сопряжённых связей,, поэтому аминокислота, несущая метку, становится окрашенной в отличие от остальных аминокислот. При последующем гидролизе меченого пептида аминная связь 2,4-динитрофенильной группы с пептидом не затрагивается, и в образовавшейся смеси аминокислот только К-концевая кислота оказывается меченой. Анализ гидролизата с помощью тонкослойной хроматографии позволяет однозначно идентифицировать N-концевую аминокислоту путём сравнения хроматографической подвижности окрашенного пятна из гидролизата с подвижностями заведомых 2,4-ДНФ-производных аминокислот. [c.56]

ВВЕДЕНИЕ КОНЦЕВОЙ МЕТКИ. Методика введения радиоактивно меченной группы в один из концов (5 или 3 ) ДНК, [c.520]

По спектрам ЭПР смесей полиизопрена и полистирола с концевыми нитроксильными спиновыми метками обнаружено [48], что полиизопрен оказывает в данной смеси пластифицирующее действие. Этот эффект имеет место на границе раздела фаз, где некоторое количество цепей полистирола находится преимущественно в окружении полиизопрена. Рассмотрение меченого полистирола как макромолеку-лярного спинового зонда показало, что эффективный объем внутреннего сегмента полистирола примерно в 1,6 раза выше, чем эффективный объем меченого конца цепи, и в 1,7 раза выше, чем внутреннего сегмента полиизопрена. [c.293]

В качестве примера электрофильной природы активированного трития можно привести получение меченого пептида с N-концевым тирозином. Так, при введении метки в нанесённый на гетерогенный катализатор пептид с N-концевым тирозином в орто-положения (к гидроксильной группе тирозина) при температуре 135 °С включалось почти в двадцать раз больше метки, чем в мета-положения, а уже при температуре 150 °С в орто-положениях [c.513]

В этом наборе фрагментов меченый 5 -концевой остаток показан на красном фоне. Обратите внимание на то, что два фрагмента помечены, а это значит, что они содержат 5 -конец исходного олигонуклеотида, в то время как фрагменты Т—А—О, А—О—С—Т—А—С и А—О не содержат метки, т. е. в них отсутствует исходный 5 -конец. Нас будут интересовать только меченые фрагменты. [c.888]

Эксперименты с мечеными соединениями в свое время вызвали сомнение в участии лимонной кислоты в цикле Кребса. Так как лимонная -кислота симметрична, то метка, введенная в одну из карбоксильных групп (верхнюю на схеме), должна была равномерно распределиться между двумя концевыми. карбоксильными группами в соответствующих Сб метаболитах, включая а-кетоглутаровую кислоту. Однако метка [c.714]

Рис. 20.20. Концевое мечение двухценочечных ДНК с помощью ДНК-полимеразы Т4. З -экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы катализирует отщепление 3 -концевых нуклеотидов фрагментов ДНК с тупыми концами (А), с выступающими З -концами (F) или с выступающими 5 -концами (В). Отщепление происходит до тех пор, пока на противоположной цепи не экспонируется основание, комплементарное меченому дезокси-рибонуклеотиду, введенному в реакционную смесь (dGTP ) затем включается полимеразная активность ДНК-полимеразы Е4, и к 3 -концу присоединяется свободный меченый дезоксирибонуклеотид. Метка включается в оба конца фрагментов ДНК (на рисунке это не показано). Для мечения можно использовать любой дезоксирибонуклеотид.

Применение в качестве инициатора азодинитрила бисизомас-ляной кислоты с меченым атомом С при исследовании механизма раздельной и совместной полимеризации метилметакрилс.та и стирола [61] позволило с большой точностью определить число концевых групп с мечеными атомами, сопоставить полученные данные с осмометрическими среднечисловыми молекулярными массами, таким образом, изучить механизм обрыва цепей. Результаты этой работы показывают, что если известен механизм обрыва, то с большой точностью можно выполнить и обратную задачу определение среднечисловой молекулярной массы. Однако сложность механизмов протекания процессов полимеризации виниловых мономеров, а-олефинов и диенов затрудняет правильную интерпретацию полученных результатов и ограничивает использование методов, основанных на введении радиоактивной метки на стадии инициирования или обрыва реакции роста. [c.118]

РНК, меченную р и 3 гидролизовали Т,-РНК-азой и продукты гидролиза разделяли по величине заряда хроматографией на колонке с DEAE -сефадексом в 7м мочевине (pH 7,6). Как упоминалось в преды душем разделе, олигонуклеотиды с н-концевой меткой были обнаружены во фракции гекса- или гептануклеотидов (восе.мь или девять отрицательных зарядов). [c.138]

Методы, используемые нами для синтеза равномерно меченных и меченных по концам одноцепочечных ДНК-зондов, очень похожи. Принцип их проиллюстрирован на рис. 10. Фрагмент ДНК, который предстоит исследовать, клонируется в репликативной форме бактериофага или в плазмидном векторе, продуцирующем одноцепочечные кольцевые молекулы только одной ориентации. Две наиболее распространенные системы такого типа — бактериофаг М13 и плазмиды, несущие точки начала репликации фага М13. Олигонуклеотидный праймер реассоциируют с одноцепочечной кольцевой молекулой так, чтобы он инициировал синтез ДНК на матрице тестируемой вставки в направлении от 5 - к З -концу. Для равномерно меченных зондов один из используемых при синтезе dNTP метится изотопами Р или в альфа-положении. Для зондов с концевой меткой олигонуклеотид метят по 5 -концу [y- PjATP, а для синтеза ДНК используют холодные dNTP. По окончании синтеза ДНК обрабатывается рестриктазой, расщепляющей кольцевую молекулу у конца вставки, противоположном сайту реассоциации с олигонуклеотидным праймером. В результате такой реакции получается линейный фрагмент ДНК, состоящий частично из двухцепочечного и частично из одноцепочечного участков. Денатурируя ДНК и проводя препаративный электрофорез в поли- [c.167]

Проблему образования димеров в РЕР-ПЦР пытаются решать с помощью варианта метода, получившего название ПЦР со случайными мечеными праймерами (tagged random primer P R - T-P R) [319]. В этом случае при амплификации использовали смесь всевозможных 9-звенных олигонуклеотидных праймеров, каждый из которых содержал 5 -концевую метку в виде постоянной 17-нуклеотидной последовательности [c.240]

Как уже отмечалось выше, для определения нуклеотидных последовательностей ДНК методом Максама-Гилберта необходимо наличие фрагментов ДНК, несущих на одном из концов какую-либо метку. Отдельные частные случаи секвенирования ДНК методом химической деградации (геномное и мультиплексное секвенирование, рассматриваемые в других главах) могут проводиться даже с немечеными препаратами ДНК. Концевое мечение секвенируемых фрагментов ДНК можно осуществить при помощи различных ферментов. Так, с помощью поли-нуклеотидкиназы фага Т4 и молекулы АТФ, несущей радиоактивный фосфор в у-положении, проводится мечение 5 -концов одно- или двуцепочечного фрагмента ДНК. Эффективность мечения тупых или 5 -углубленных концов двуцепочечного фрагмента ДНК значительно ниже, -чем 5 -выступающих. Для более эффективного мечения необходим предварительный этап дефосфорилирования фрагмента ДНК с помощью щелочной фосфатазы. Особая забота должна быть проявлена при последующем удалении щелочной фосфатазы, что достигается обычно фенольной депротеинизацией, так как остаточная фосфатазная активность может резко снизить эффективность этапа мечения. Мечение путем обменной реакции позволяет обойтись без этапа дефосфорилирования и требует присутствия в реакционной смеси в качестве акцептора молекул АДФ, однако эффективность мечения при этом будет значительно ниже. [c.22]

Для автоматического секвенирования ДНК, как и для обычного, применяют и внутреннее мечение с помощью несущих флуоресцентную молекулу различных дНТФ, и 5 -концевую метку в виде олигонуклеотидного праймера с флуорофором и 3 -концевую метку, образующуюся за счет терминации синтезируемых цепей ДНК ддНМФ, со дер- [c.314]

В тех случаях, когда рестриктаза расщепляет ДНК с образованием З -выступающих концов, 5 -киназная метка фрагментов позволяет определить лишь меньшую часть узнаваемой последовательности. Для полной идентификации сайта необходимо провести анализ З -концевой структуры рестриктов. Робертсом [217] было предложено в таких случаях для введения З -концевой метки использовать терминальную трансферазу. Практически этот подход впервые был реализован в опытах по определению специфичности рестриктазы Крп I [274]. Анализ З -меченой ДНК проводится как и в случае 5 -концевой метки, с той лишь разницей, что для получения продуктов частичного гидролиза используются микрококковая нуклеаза и фосфо-диэстераза селезенки, т. е. нуклеазы, расщепляющие ДНК с образованием З -фосфатов. [c.176]

Для большинства опытов по картированию активных центров карбогидраз олигосахаридные субстраты должны быть меченными С по одной из концевых групп. Например, в случае мальтоолигосахаридов введение метки в восстанавливающую концевую группу проводят с помощью циклодекстрин-глюканотрансферазы (КФ 2.4.1.9), действуя на циклогексаамилозу и меченую глюкозу [c.39]

Биогенетическая взаимосвязь сквалена и холестерина предполагалась еш,е до 1926 г., однако достоверно участие сквалена в образовании углеродного скелета холестерина было установлено лишь в 1953 г. после того, как было выяснено распределение радиоактивной метки в холестерине, образующемся из меченого ацетата. Распределение меток в холестерине, полученном в опытах с ацетатом и мевалонатом, показано соответственно формулами (7), (38) и (39). Положения атомов в холестерине, полученном из [5- С]- и [3, 4- С2] мевалонатов, недавно установлено методом ЯМР [36]. В результате стереоспецифической циклизации сквалена в молекуле появляется концевая транс-метильная группа, которая метится, если используется [2- С] мевалоновая кислота из этой группы возникает 4а-метильная группа ланостерина. [c.494]

Абсцизовая кислота (109) является широко распространенным регулятором роста растений важное биологическое значение этой кислоты обусловило интенсивное исследование путей ее биосинтеза [78]. Для этого была использована бесклеточная система из плодов авокадо. Хотя абсцизовую кислоту можно рассматривать как продукт деградации каротиноидов, однако при введении [ С] фитоина в эту бесклеточную систему радиоактивная метка включается только в каротиноиды, но не в абсцизовую кислоту. В то же время абсцизовая кислота приобретает три метки из [2- С] мевалоната. Концевая г<ис-двойная связь метится изотопами водорода из 4-рло-(i )-мевалоната и, следовательно, образуется на какой-то стадии из транс-двойной связи. Опыты с мевалонатом, стереоспецифически меченным при С-2 и С-5, показали, что при образовании двойной связи наблюдается только транс-элиминирование от атомов С-4 и С-5 предшественника абсцизовой кислоты с потерей 2-p/ o-(S)- и 5-рло-(7 )-водородных атомов мевалоната. Гидроксиэпоксид (-)-)-2-г<ггс-ксантоксиновая кислота (ПО) является предшественником 7-гидрокси-а,р-ненасыщенного кетона— абсцизовой кислоты. 2-рло-(S)-Водородный атом мевалоната при образовании двойной связи теряется от С-З -атома, а 4-pro- R)-водородный атом мевалоната — от С-Г-атома при введении кислородной функции. Метильные группы метятся, как показано в фор- [c.513]

Уменьшение количеств белков и пептидов, необходимых для анализа их структуры, является одной из центральных проблем, стоящих перед исследователями. С целью ее решения ведется поиск новых методов изучения структуры, в частности более чувствительных способов идентификации производных аминокислот (см. с. 61). Один из перспективных подходов заключается в широком использовании радиоактивных методов анализа. В ряде лабораторий при деградации пептидов в секвенаторе применяется радиоактивный или С-ФИТ1Д. Можно вводить радиоактивную метку непосредственно в анализируемый белок. Для многих белков это достигается добавлением радиоактивно меченных аминокислот непосредственно в питательную среду, на которой выращивается культура, являющаяся источником исследуемого белка. Таким же путем оказывается возможным радиоактивно метить белок избирательно по определенным аминокислотным остаткам. Если белок, радиоактивно меченный, например, по остаткам лейцина, анализировать с помощью секвенатора, то простое измерение радиоактивности экстрактов, содержащих анилинотиазолиноны, позволяет безошибочно определить, в каких положениях полипептидной цепи в N-концевой области белка расположены остатки лейцина (рис. 31). Аналогичным образом можно определить положение и других аминокислотных остатков. Такой прием используется для анализа N-koh-цевой последовательности предшественников белков, доступных лишь в ничтожно малых количествах. Для исследования полной структуры он, однако, не применяется из-за дороговизны и трудоемкости. [c.79]

Методы включения метки в З -концевые группы более разнообразны. Так, а двухцепочечные ДНК метка вводится в составе (а- Р1-дез-оксирибонуклеозидтрифосфатов с помощью ДНК-полимеразы I Е. соИ или фага Т4 (см. с. 348). Двух- и одноцепочечные ДНК могут быть помечены по 3 -концевому звену с использованием концевой нуклеотидилтрансферазы. В одном из вариантов этого метода к З -ОН-группе олигодезоксирибонуклеотида присоединяются а- Р -меченые рибонуклеозидтрифосфаты. После ферментативной реакции продукт подвергается щелочному гидролизу, в результате чего на З -конце образуется только одно рибонуклеотидное звено. Во втором способе используются аналоги природных нук- [c.316]

Проблемой, которую каждый раз приходится решать при использовании метода Максама — Гилберта, является получение полинуклеотидов, меченных только по одному из концов. Обычно для анализа используются двухцепочечные фрагменты ДНК (например, образовавшиеся после расщепления рестриктазами), а все методы введения концевых меток приводят к образованию фрагментоа, меченных по двум 5 - нлн двум 3 -концам. Поэтому приходится прибегать к дополнительным операциям, таким, как разделение комплементарных цепей ДНК после введения метки. [c.325]

Деятельность обоих ферментов различается очень резко, что хорошо видно при сравнении образующихся веществ. Продукт, синтезированный с помощью концевого фермента, был обработан фосфодиэстеразой змеиного яда, последовательно состригающей нуклеотидные звенья с З -гидроксильного конца цепи. За 4 час 97 % включившейся метки перешло в кислоторастворимые соединения, причем эти нуклеотиды составляли лишь 8% всего синтезированного нолинуклеотрща. Отсюда видно, что имело место концевое включение меченого нуклеотида. С другой стороны, из продукта, образовавшегося иод действием ренликационного фермента, за то же время высвобождалось только 55% радиоактивности. Отсюда следует, что значительная часть включившехтся метки не локализована на концевом участке ДНК или возле него. [c.211]

С помощью химического и ферментативного гидролиза было показано, что синтетические полинуклеотиды, как и РНК, состоят из нуклеозид-5 -монофосфатных единиц, связанных между собой 3, 5 -фосфодиэфирными связями (стр. 46). Анализ концевых групп показал, что на конце полипептидной цепи находится фосфатная группа, этерифицированная по С-5 концевого нуклеозида. При гидролизе щелочью, фосфодиэстеразой змеиного яда, фосфодиэстеразой из селезенки или панкреатической рибонуклеазой эти полимеры дают точно такие же продукты, как и РНК. Очоа и его сотрудники воспользовались перечисленными свойствами, чтобы выяснить природу межнуклеотидных связей, образуемых с помощью фермента. Они синтезировали (А, Г, У, Ц)-полимер из смеси нуклеотидов, содержавшей АДФ, меченный по фосфору, и затем гидролизовали его фосфодиэстеразой змеиного яда (фиг. 87). Из полученных после гидролиза четырех нуклеозид-5 -фосфатов меченым оказался только АМФ, и его удельная радиоактивность соответствовала удельной радиоактивности первоначально включенного АМФ. Следовательно, во время синтеза фосфоэфирпая связь АМФ не затрагивалась. Если же синтезированный полимер гидролизовали щелочью или фосфодиэстеразой селезенки, то метку включал каждый из четырех пуклеозид-З -монофосфатов. Значит, в ходе синтеза полинуклеотидфосфорилаза формирует связи А—ф—А, Ц—ф—А, У—ф—А и Г—ф—А. Аналогичные результаты были получены с Р -УДФ. [c.253]

При смешивании гемоглобина плода НЬР с меченым НЬА при рН4 и последующей нейтрализации раствора образуется гемоглобин плода с меткой в а-цепи. Очевидно, а-цепи, содержащиеся в НЬА и в НЬР, идентичны. Вторая пара цепей НЬР содержит М-концевой пептид Гли-Гис-Фен, и для НЬР принято обозначение (a2V2). Индивидуумы, гомозиготные по гену НЬ8, должны иметь нормальный НЬР. Вместе с тем у индивидуумов, гемоглобин которых имеет аномалии в а-цепях, можно ожидать аномалий в гемоглобине плода. Последовательности аминокислот в у- и р-цепях более сходны друг с другом, чем с последовательностью в а-цепи. Можно предположить, что р-цепь развилась из у-Цепи, которая в свою очередь произошла из а-цепи. Был найден также гемоглобин НЬН, состоящий из четырех р-цепей. Предполагается, что появление этого гемоглобина связано с избытком р-цепей в эритроцитах. Механизм появления аномальных гемоглобинов человека получает простое объяснение на основе гипотезы один ген — одна полипептидная цепь , которая, однако, пока не доказана. К этому вопросу, представляющему интерес для химии белка и для генетики, мы еще вернемся в гл. XX. [c.227]

Однако сначала следует отметить некоторые ранее не упомянутые детали, касающиеся распределения метки. Было найдено, что концентрация диоксиацетонфосфата значительно превышает концентрацию глицеральдегидфосфата. После очень кратковременных экспозиций в присутствии С Ог отношение С С для диоксиацетонфосфата имеет меньшую величину, чем для глицеральдегида, из которого он образовался. Следовательно, диоксиацетонфосфат характеризуется меньшей удельной активностью концевого углеродного атома, чем глицераль-дегидфосфат. При конденсации этих по-разному меченных триозофосфатов должен образоваться гексозофосфат, меченный по углеродному атому в положении 3. Именно такое распределение метки удалось экспериментально показать Кандлеру и Гиббсу [271. [c.544]

Смотреть страницы где упоминается термин Концевая метка концевое мечение : [c.259] [c.391] [c.130] [c.297] [c.64] [c.411] [c.484] [c.20] [c.506] [c.20] [c.138] [c.517] [c.261] [c.40] [c.318] [c.196] [c.492] [c.210] [c.282] [c.81] [c.225] [c.131] [c.346] [c.347] [c.353]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология