Рестриктазы классы

Рис. 1.7. Модель действия рестриктаз класса I на молекулу ДНК

Таблица 1.2. Некоторые рестриктазы класса II

Полипептидная цепь рестриктаз класса II состоит из двух доменов - распознающего ДНК и каталитического. Исходя из этого, были получены химерные белки, содержащие домены разных ферментов (не обязательно рестриктаз), и исследована их специфичность. Наибольшей функциональностью обладал гибридный [c.443]

Рестриктазы класса II — относительно просто организованные белки, состоящие из двух субъединиц одного типа со сравнительно небольшой молекулярной массой. Отличительной чертой рестриктаз класса II является то, что они узнают и разрезают немодифицированную двухцепочечную молекулу ДНК по специфичным нуклеотидным последовательностям, и это приводит к образованию дискретного набора фрагментов анализируемой ДНК (см. рис. 1.6). Для специфического действия этих ферментов требуются только ионы М 2+ в физиологических концентрациях. Рестриктазы класса II обычно узнают последовательности двухцепочечной ДНК длиной от 4 до 8 пн, имеющие ось симметрии второго порядка, — палиндромы. [c.16]

Большинство рестриктаз класса II узнают на ДНК последовательности, содержащие от 4 до 6 нуклеотидных пар, обладающих осью симметрии второго порядка. В 1973 г. американские И1-следователи X. Смит и Д. Натане предложили номенклатуру для обозначения ферментов системы рестрикции — модификации. В соответствии с этой номенклатурой, которая сегодня является общепринятой, первая буква рода и две первые буквы вида образуют состоящие из трех букв сокращения источника выделения фермента. Эндонуклеазы обозначают символом R, метилазы — М. Если из одного типа клеток выделены два или больше ферментов рестрикции, то их нумеруют соответственно римскими цифрами. Исходя из этой номенклатуры рестриктазы Е. oli [c.139]

Внесение большого избытка рестриктазы класса II в реакционную смесь может вызывать наряду с нормальным гидролизом расщепление ДНК по дополнительным участкам. Нарушение специфичности действия рестриктаз может также происходить при снижении ионной силы. [c.20]

Примером рестриктаз класса 2, специфически расщепляющих ДНК, может служить рестриктаза oRI, действие которой поясняется ниже. Последовательность, распознаваемая этим ферментом, состоит из шести пар оснований, образующих палиндром (в двух цепях последовательности одинаковые, но идут в противоположных направлениях). [c.469]

Рестриктазы класса II. Системы рестрикции-модификации класса II состоят из отдельных белков рестрикционной эндонуклеазы и модификационной метилазы. Поэтому рестриктазы данного класса можно выделить в индивидуальном состоянии, свободном от метилазной активности, что в значительной мере упрощает их изучение и последующее использование для расщепления молекул ДНК. [c.16]

II и III. Все рестриктазы узнают на дв)спиральной ДНК строго определенные нуклеотидные последовательности. Однако рестриктазы класса I осуществляют разрывы в произвольных точках молекулы ДНК, а рестриктазы классов II и III узнают и расщепляют ДНК в строго определенных точках внутри сайтов узнава-нмя или на фиксированном от них расстоянии. Ферменты типов 1 и III имеют сложную субъединичную структуру и обладают двумя типами активностей — модифицирующей (метилирующей) и АТФ-зависимой эндонуклеазной. Ферменты И-го класса состоят из двух отдельных белков рестрицирующей эндонуклеазы и модифицирующей метилазы. В силу указанных причин в генной инженерии используют исключительно рестриктазы класса II. [c.139]

Рестриктазы классЕ I расщепляют ДНК в произвольных местах на расстоянии от нескольких сот до нескольких тысяч пар нуклеотидов от сатов узнавания, образуя при этом сплошной спектр рестриктов. Поэтому эти рестриктазы в генетической инженерии практически не используют, так как с их помощью нельзя получить фрагменты ДНК, строго детерминированные по размерам и содержанию информации. Тем не менее, знакомство с RM-система-ми щтаммов Е. соН, относящимися к классу I, необходимо ввиду того, чго именно в этих клетках (главным образом штамма К-12) ведут тестирование чужДНК. Их рестриктазы и метилазы объединены в один комплекс с белком S, обеспечивающим связь всего комплекса с сайтом узнавания, если сайт не метилирован. Как и все сайты узнавания ферментов этого класса, ЕсоК-сшт несимметричен [c.164]

У рестриктаз класса 11 сайты расщепления совпадают с сайтами узнавания или находятся рядом с ними на строго определенном расстоянии, что позволяет получать рестрикты определенной длины. Кроме того, рестриктазы и метилазы этого класса действуют независимо, что весьма удобно в экспериментальном плане. Поэтому они широко применяются для генетического конструирования in vitro, выделения генов, их физического картиро- [c.164]

По способу расщепления ДНК рестриктазы класса II распадаются на два типа. Одни осуществляют ступенчатый разрез нитзй ДНК (пеложения гидролизуемых связей на разных нитях не совпадают), а другие — прямой (расщепляются совпадающие связи). В результате у фрагментов ДНК образуются, соответственно, выступающие однонитевые или ровные (тупые) концы. Конечно, в местах разрезов (i,T) выступающие последовательности нуклеоти-[ов, относящиеся к разным нитям ДНК, являются комплементарными (липкими). В случае действия рестриктаз подкласса IIP, узнающих палиндромные сайты, все рестрикты обладают липкими концами. Пример этого типа рестриктаз — эндонуклеаза ЕсоШ, образующая 5 -выступающие концы [c.166]

Рестриктазы класса III сходны с рестриктазами класса I в том, что они действуют в одном комплексе с метилазами и узнают несимметричные последовательности нуклеотидов. Комплекс состоит из двух субъединиц. Способность к специфическому связыванию с ДНК присуща только метилазе, поэтому ее называют MS-субъединицей. Расщепление ДНК R-субъединицами происходит на определенном расстоянии от сайтов узнавания. Например, рестриктаза E oPl характеризуется сайтом AGA (27/25). [c.169]

Рестриктазы класса I. Наиболее изученными рестриктазами класса 1 являются ферменты ЕсоК и ЕсоВ, выделенные соответственно из клеток Е. oli К12 и Е. соИ В. Это ферменты с очень схожей структурой. Оба содержат три типа неидентичных субъединиц с молекулярной массой 135,60 и 50 кДа (а,риу), хотя соотношение субъединиц различается для этих двух ферментов. Например, ЕсоК имеет структуру агР- у. В случае ЕсоВ ситуация более сложная, так как выявлет.1 по крайней мере три активные олигомерные структуры, основная из которых имеет состав 2 8472- [c.15]

Рестриктазы класса I специфичны к немо-дифицированной двухцепочечной ДНК и обладают следующими свойствами требуют в качестве кофакторов аденозинтрифосфат (АТР), [c.15]

Ф. Студиэр и П. Бэндепедхяй в 1988 г. на основе подробного изучения гидролиза ДНК фага Т7 рестриктазой соК предложили общую модель действия рестриктаз класса I на ДНК. Суть этой модели состоит в том, что рестриктаза класса I после взаимодействия с ДНК в участке узнавания начинает осуществлять АТР-зависи-мую транслокацию (перемещение) цепей ДНК через себя в обоих направлениях (рис. 1.7). При встрече двух соседних молекул фермента, транслоцир)оощих ДНК, они разрезают двухцепочечную ДНК в районе контакта. Гетерогенность продуктов гидролиза ДНК рестриктазами класса I может объясняться неодновременным случайным взаимодействием молекул фермента с разными участками узнавания на каждой молекуле ДНК, а следовательно, неодновременным началом транслокации цепей ДНК. Кроме того, не исключена возможность неравномерной транслокации цепей на разных молекулах препарата ДНК. [c.16]

Некоторые из рестриктаз класса II перечислены в табл. 1.2. Для крат1 )сти изображена одна цепь узнаваемой последовательности нуклеотидов в направлении 5 -3. Вторая цепь расщепляется симметрично, как в приведенных выше примерах для рестриктаз Alul, ЕсоШ и Pstl. [c.17]

Важно отметить, что спермидин (полиамин, являющийся существенным компонентом прокариотических клеток) значительно увеличивает точность гидролиза ДНК рестриктазами класса II in vitro. Это свидетельствует, что в клетке ошибочный гидролиз ДНК рестриктазой если и происходит, то крайне редко. [c.20]

Так, П. Мозес и К. Хориучи (1979 г) продемонстрировали, что репликативную форму ДНК фага fl, расщепленную рестриктазой Hgal на шесть фрагментов, можно с помощью ДНК-ли-газы с высокой эффективностью собирать в биологически активную кольцевую ДНК, дающую после трансфекции клеток начало фаговому потомству. При гидролизе той же фаговой ДНК рестриктазой класса II, формирующей одинаковые липкие концы, уже практически невозможно из шести фрагментов в процессе лигазной реакции восстановить молекулу ДНК нативной структуры, так как все фрагменты будут объединяться статистически в а1шхразлишшх-ком-бинациях., - - [c.21]

Рестриктазы класса III имеют некоторое сходство с рестриктазами класса I. Нативный фермент состоит из двух различных субъединиц и бифункционален, т. е. обладает как рест-риктазной, так и метилазной активностью. Рестриктазы класса III узнают несимметричные по- [c.21]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология