Флуоресценция зондов

Изучают влияние НАД, пирувата и АДФ на флуоресценцию аурамина О, связанного с ЛДГ. Для этого вначале снимают спектр флуоресценции раствора, содержащего 0,04 мМ апо-ЛДГ и 0,15 мМ аурамина О в 0,1 М К-фосфатном буфере (pH 7,0), содержащем 5 мМ ЭДТА, а затем добавляют к пробе лиганды в следующих конечных концентрациях 6 мМ НАД, 6 мМ пируват, 9 мМ АДФ. Регистрируют увеличение флуоресценции комплекса аурамина О с ЛДГ под действием использованных соединений. Ставят контроль, в котором учитывают влияние добавок на флуоресценцию зонда в отсутствие белка. Рост интенсивности эмиссии связанного с белком аурамина О может быть обусловлен либо увеличением его количества, либо изменением флуоресцентных характеристик зонда. В любом случае увеличение флуоресценции зонда при связывании лигандов в активном центре свидетельствует о конформационной перестройке участков моле- [c.343]

На рис. 3 представлены кривые зависимости интенсивности флуоресценции зонда 1,8-АНС, находящегося в мембранах липосом от концентрации пропиленгликоля или ПЭО-400. Добавление пропиленгликоля к взвеси липосом приводило к монотонному уменьщению интенсивности флуоресценции зонда 1,8-АНС вследствие его вытеснения молекулами пропиленгликоля из мембран в воду и дальнейшим тушением флуоресценции. Похожая зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации ВВ наблюдалась и при добавлении ПЭО-400 к липосомам. Однако при концентрациях 5-10 % происходило увеличение интенсивности флуоресценции зонда, что указывало на переход зонда из гидрофильного в гидрофобное микроокружение. Повидимому, при этих концентрациях происходит некоторая деструкция мембран липосом по типу разрыхления, которая приводит к появлению дополнительных мест связывания зонда на мембране. [c.563]

Рис. 8. Спектры флуоресценции зонда 1,8-АНС в

Наблюдаемое увеличение флуоресценции зонда в присутствии белка отражает связывание аурамина О с ЛДГ, т. е. [c.342]

Для количественного анализа взаимодействия проводят другой эксперимент, в котором определяют максимальный прирост интенсивности флуоресценции зонда при его полном связывании с белком. При этом постоянную низкую концентрацию аурамина О (которую выбирают таким образом, чтобы можно было зарегистрировать флуоресценцию зонда в буфере) титруют нарастающими количествами фермента. Строят график двойных обратных величин и проводят экстраполяцию к бесконечной концентрации белка. Таким образом устанавливают значение интенсивности флуоресценции данной концентрации зонда при его полном связывании с ЛДГ. Соотношение полученной величины с флуоресценцией данной концентрации зонда в буфере показывает, во сколько раз увеличивается флуоресценция аурамина О при связывании. Используют несколько концентраций аурамина О для титрования белком, что повышает точность определения величины прироста флуоресценции (Фтах). В этих экспериментах [c.342]

Рис.З. Зависимость интенсивности флуоресценции зонда 1,8 - АНС в суспензии липосом от концентрации ПЭО-400 (1) и пропиленгликоля (2)

На рис. 8 представлены спектры флюоресценции зонда 1,8-АНС в липосомах в присутствии ряда флавоноидных соединений. Введение флавоноидных соединений в взвесь липосом приводит к падению интенсивности флуоресценции зонда. Такое действие возможно вследствие двух причин. Во-первых, изучаемые вещества поглощают в области 365 нм, т.е. в области возбуждения флуоресценции зонда. Кроме это- [c.575]

Из анализа рисунка следует, что при взаимодействии эритроцитарных мембран с ЛДГ, облученной УФ-светом при указанных значениях pH, не выявляются статистически достоверные отличия значений интенсивности флуоресценции зонда в комплексе мембраны — ЛДГ в нативном состоянии и в комплексе мембраны — УФ-облученный фермент . [c.183]

Чтобы сделать выбор между двумя возможными объяснениями эффекта, определяют концентрацию НАД, необходимую для получения холоформы ЛДГ, добавляя к комплексу апо-ЛДГ с зондом (с. 340) НАД до тех пор, пока флуоресценция аурамина О не перестанет увеличиваться. Затем в отдельной пробе титруют холо-ЛДГ аурамином О (так же, как апо-ЛДГ) определяют число участков и величину к для комплекса аурамина О с холо-ЛДГ. В случае совпадения полученных значений с величинами, определенными для апофермента, увеличение интенсивности флуоресценции зонда при связывании НАД с апо-ЛДГ объясняют изменениями структуры аураминсвязывающих областей молекулы белка в результате изменения состояния активного центра. [c.344]

На рис.7 представлены спектры флуоресценции зонда в липосомах в присутствии некоторых веществ ряда аминотиазола, а в табл. 1 относительные изменения интенсивности флуоресценции в процентах. Для нитазола интенсивность флуоресценции представлена с учетом поглощения в районе 365 нм. Сродство веществ к липосомам увеличивается в ряду ацетазол < хлотазол < хлорэтидиазол < бис-тиазол < нитазол. [c.573]

В первой части работы приводятся химические сдвиги и времена спи№-решеточной релаксации (величины Г, ) для различных разрешенных пиков в спектрах ЯМР Ни спектрах ЯМР С с развязкой по протонам водных растворов перечисленных выше ПАВ. Эти данные свидетельствуют о градиенте подвижности сегментов углеводородных цепей, а также фрагментов оксиэтилена. С помощью кинетического анализа экспериментов по тушению флуоресценции последовали проницаемость мицелл неионогенных ПАВ по отношению к различным ионным и нейтральным веществам. Флуоресценция зондов, присутствующих либо в форме ковалентно связанных (фенок-сильных) фрагментов, либо введенных извне (пирен), тушится молекулами внутри неионной мицелпы. Изучение основных фотофизи— ческих свойств феноксильной группы дает информацию относительно окружения вокруг хромофора в этих неионных мицеллах. О солюбилизации пирена вблизи феноксильной группы судили по эффективному переносу энергии синглетного возбуждения. Особенности зоны солюбилизации пирена в гидрофобном ядре мицеппы приводят к интересным фотохимическим следствиям. Например, фотолиз рубиновым лазером с длиной волны 347,1 нм гшрена, растворенного в неионогенных ПАВ, приводит к эффективной фотоионизации. [c.308]

Введение монохлорацетата 1-(3,6-диазагексил)-2-(1 -метил-пентил)-4,5-дигидро-1,3-Диазола резко снижает содержание первичных и вторичных перекисных структур в миокарде и мозге при отравлении армином, эффективно нормализует микровязкость эритроцитарных мембран (увеличивается интенсивность флуоресценции зонда АНС) и по широте терапевтического действия (LD50/ED50) в 6.5 раз превосходит 2,(з-д.и-трет-6у-тил-4-метил-фенол (ионол) (табл. 6). [c.334]

Рис. 53. Интенсивность флуоресценции зонда 1,8-АНС в комплексе с эритроцитарными мембранами и ЛДГ, модифицированной УФ-излучением, при pH 7,4 (л), 5,4 б), 4,5 (< ) 1 — интенсивность флуоресцен1ЩИ АНС в комплексе с эритроцитарными мембранами и ЛДГ в нативном состоянии 2 — интенсивность флуоресценции АНС в комплексе с эритроцитарными мембранами и УФ-облученным ферментом

Для регистрации спектров флуоресценции зондов 1,8-АНС и DANS-глицина в комплексе с нативными и УФ-облученными эритроцитарными мембранами необходимо использовать установку, описанную в работе В. Г. Артюхова, О. В. Путинцевой (1996). В ней в качестве источника света применяют ртутную лампу СВД-120. Возбуждающий свет выделяется с помощью светофильтра СЗС 7—2 и падает на кювету с исследуемым образцом. Люминесценцию растворов зондов измеряют при помощи многоходовой кварцевой кюветы объемом 4 мл с зеркальными стенка- [c.250]

Для изучения спектров флуоресценции зонда DANS-глицина в комплексе с суспензией нативнЕ х и УФ-модифицированных мембран эритроцитов указанные растворы в объеме 1 мл необходимо смеп1ать с 0,5 мл раствора зонда и 1,5 мл 10 ммоль/л трис-НС1 буфера (pH 7,6 при 20 С) и инкубировать смесь в течение 15 мин, затем регистрировать спектры флуоресценции в интервале длин волн 500—550 нм. [c.251]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология