Конструирование рекомбинантной ДНК

Рис. 13 3. Схема конструирования рекомбинантного вируса осповакцины.

После того как получены вектор и вставка, можно приступать к конструированию рекомбинантных ДНК. Обычно нужно осуществить только два двухцепочечных соединения независимо от того, представляет ли собой вектор линейную плазмиду или вирусный геном или два плеча ДНК фага X объединены в одну линейную молекулу по со5-сайтам. Если вставки имеют тупые концы, то перед лигированием для его облегчения к ним часто присоединяют липкие концы. [c.286]

Векторные плазмиды и векторные вирусы со встроенными чужеродными генами часто называют гибридными (шти химерными) плазмидами (или фагами). После конструирования рекомбинантных ДНК их с помощью трансформации вводят в реципиентный организм бактериальную, грибную, растительную или животную клетку. Трансформация предусматривает предварительную обработку клеток соединениями, обусловливающими проникновение ДНК внутрь клеток с последующим их помещением в среду, в которой способны существовать только клетки, получившие векторную молекулу, например в среду с определенным антибиотиком. [c.120]

Современное руководство по биотехнологии, написанное авторитетными канадскими учеными. В книге подробно изложены основы генной инженерии механизмы репликации, транскрипции и трансляции методы клонирования, амплификации и секвенирования ДНК конструирование рекомбинантных ДНК введение последовательностей-мишеней в геном микроорганизмов, растений и животных, а также практическое применение генной инженерии для получения лекарственных веществ, вакцин, факторов роста, инсектицидов и т.д. Большое внимание уделено генной терапии и связанным с ней морально-этическим проблемам, патентованию биотехнологических продуктов и способов их получения. [c.4]

Учебник построен таким образом и написан таким языком, что им могут пользоваться студенты-биологи, химики и даже будущие врачи. По каждой теме даются ссылки на работы, в которых представлены оптимальные методики конструирования рекомбинантных организмов, исследования их функционирования, определения качества и количества целевых продуктов. Текст прерывается вставками, названными Важная веха . Они представляют собой рефераты ключевых научных статей, которые действительно стали важными вехами в истории современной биотехнологии. [c.5]

Некоторые изменения в организации и изложении материала по сравнению с первым изданием начинаются уже в первой части. Раздел о составлении хромосомных карт у эукариот (глава 5) был переписан и расширен в соответствии с замечаниями преподавателей и наших собственных студентов. Новая глава 6 посвящена комплементационному анализу и изучению тонкой структуры гена как у прокариот, так и у эукариот. Глава, в первом издании шедшая под номером девять, (Репликация, репарация и рекомбинация ДНК) превратилась в главы 13 и 14, перенесенные во вторую часть, поскольку акцент смещен на функционирование генов, обеспечивающих процессы репликации и рекомбинации ДНК. Новая глава 9 Методы работы с ДНК завершает первую часть, поскольку вопросы конструирования рекомбинантных ДНК и анализа последовательности нуклеотидов в ДНК, строго говоря, относятся к теме Организация и передача генетического материала . Главы 6 и 7 были дополнены новыми появившимися в последние годы данными и получили в этом издании номера 7 и 8 соответственно. Значительная часть материала, входившего ранее в главу 8, в этом издании помещена в главы 6 и 14. [c.8]

Общепринятые методы работы с рекомбинантной ДНК позволяют переносить генетическую информацию от одного организма к другому. Однако клонированная чужеродная ДНК содержит небольшое число генов, часто только один структурный ген, кодирующий один белок, который катализирует определенную реакцию. Учитывая генетические методы получения штаммов микроорганизмов, способных к детоксикации окружающей среды, значение общепринятых методов конструирования рекомбинантной ДНК ограничено. С этой целью более широко используется конструирование необходимых организмов при помощи природных генетических механизмов обмена. Очевидно, однако, что конструирование рекомбинантной ДНК может быть использовано для усовершенствования этих деградативных [c.329]

В. Конструирование рекомбинантных геномов. .... [c.8]

Особую ценность для генной инженерии представляют рестриктазы, под действием которых образуются фрагменты с само-комплементарными липкими концами они эффективно используются при конструировании рекомбинантных молекул. [c.141]

Способность микроорганизмов разрушать ксенобиотик или другой поллютант зависит от наличия в клетках генов, определяющих синтез ферментов, участвующих в деградации соединения. Конструирование рекомбинантных штаммов - деструкторов ксенобиотиков закл очается в объединении нескольких генов или их блоков, ответственных за первичный [c.341]

Примерно такой, но на самом деле намного более сложный, путь исследований в генной инженерии привел за последние 30 лет к клонированию множества генов, в том числе и неизвестных ранее, определению их структуры и особенностей функционирования. Аналогичные подходы легли в основу многих новых направлений молекулярной биологии и генетики. Об использовании этих методов при целенаправленном конструировании рекомбинантных белков речь пойдет во второй части книги. [c.254]

Вспомогательные плазмиды, используемые для конструирования рекомбинантных вирусов, полезны сами по себе в опытах, в которых достаточно наблюдать временную экспрессию клонированных генов. [c.402]

Pu . 14.21. Конструирование рекомбинантных аденовирусных геномов гомологичной рекомбинацией в Е. соН [c.380]

Большое значение методы конструирования рекомбинантных VA имеют для выяснения [c.397]

В части II (гл. 4—7) описаны подходы к конструированию рекомбинантных молекул ДНК, их клонированию, отбору и характеристике, а также другие экспериментальные методы, использующиеся в молекулярной генетике. Основное внимание уделяется принципам этих методов, а не лабораторным приемам. Читатели, которых больше интересуют методические детали, могут обратиться к замечательным сборникам, вышедшим за послед- [c.6]

Конструирование рекомбинантных молекул иа базе подобных векторов, т. е. введение в них гетерологичных структурных генов, осуществляется с помощью стандартных молекулярногенетических процедур [8, 9]. Аммерер [26] опубликовал интересную методическую статью, посвященную экспрессии в дрожжах генов с использованием промотора add. Эффективность лигиро- [c.218]

Конструирование рекомбинантного ретровирусного вектора начинают с получения челночного вектора, который реплицируется в оетках Е. соИ, а затем трансфицируется в оетки животных. Однако последовательности Е. сой-плазмид утрачиваются на начальных этапах трансфекции, поскольку транскрипция в клетках животных протекает только в направлении от 5 -LTR к З -LTR (рис. 5.41). Упаковываемые в вирионы РНК-геномы не содержат сегментов плазмидного вектора. Часто это не имеет значения для последующего эю перименти-рования, однако в некоторых случаях возможность [c.271]

Чтобы избежать получения неоднозначных результатов, чрезвычайно важно уметь надежно сохранять и вести селекцию специальных бактериальных штаммов (приложение 1 [ПА]). Ниже описаны основные бактериологические методики конструирования рекомбинантных векторов для трансформации растений. Большинство бактер)иальных штаммов несет опециф ичные селективные маркеры, часто внехромосомные сохранность маркеров следует регулярно тестировать, чтобы избежать возможной контаминации, мутации или утраты специфичных плазмид. Многие штаммы будут использоваться часто, тогда как другие от случая к случаю таким образом, необходимы методы как быстрого размножения генетически чистых бактериальных колоний, используемых в качестве инокулята для засева культур больших объемов, так и длительного хранения важных штаммов. В приложении 1 [ИВ] приведены среды для селекции часто используемых бактериальных штаммов. [c.39]

Среди искусственных систем биосинтеза белка важное место занимают бесклеточные системы [260]. Любая бесклеточная система создается, прежде всего, для моделирования конкретных биохимических процессов, происходящих в живом организме, и во время функционирования воспроизводит некоторые существенные особенности жизнедеятельности клетки. В генной инженерии бесклеточные белоксинтезирующие системы часто используются для исследования кодирующего потенциала и механизмов экспрессии клонированных генов in vitro, а также на промежуточных этапах конструирования рекомбинантных генов для идентификации мРНК или фрагментов ДНК по кодируемым белкам. [c.185]

Рис. 13-5- Строение вспомогательной плазмиды BlueBa His2, используемом конструирования рекомбинантных бакуловирусов Знак с> в дуплексе — инициирующий кодон для синтеза гибридного белка, M S — полилинкер для встраивания целевого гена

Размеры ДНК некоторых вирусов, используемых в качестве екторов, превышают 100 т.п.н., что затрудняет работу т vitro. Какой )ием используют лш конструирования рекомбинантного вируса [c.431]

В создании векторов на основе элементов EBV можно выделить две стратегии (а) конструирование рекомбинантных плазмид, включающих как ori Р, так и ген EBNA-Г, (б) конструирование плазмид, которые включают только ori Р или один из его двух элементов (DS или FR). В последнем случае выявление характеристик экстрахромосомного поддержания конструкций проводится в клетках конститутивно продуцирующих белок EBNA-1. [c.222]

Первые эксперименты по созданию рекомбинантной ДНК состояли в соединении ДНК, вьще-ленной из вирусов, которые вызывали опухоли у мелких лабораторных грызунов, с фрагментами ДНК из хорошо изученных вирусов. Намерения ввести эти новые молекулы ДНК в бактериальные клетки вызвали серьезные нарекания, но вскоре было принято решение приостановить подобные попытки, и все страсти улеглись. Следующим крупным шагом было конструирование рекомбинантной ДНК, содержащей ген, который обеспечивал устойчивость бактерий к антибиотикам. Возможность генетической трансформации живых клеток путем введения необычных молекул ДНК в бактерии поставила вопрос о том, что такие бактерии могут вызывать развитие опухоли или приобретут резистентность к важным в медицинском отношении антибиотикам. Эти вопросы обсуждались как на научных конференциях, так и в частных беседах. На одной из таких конференций в июне 1973 г. участвующие в ней ученые решили привлечь внимание Национальной академии наук к этой перспективной области исследований и попросить провести направленное исследование для оценки потенциальной опасности манипуляций с рекомбинантными ДНК. Чтобы придать гласность этому обращению, ученые опубликовали письмо в журнале "S ien e". [c.8]

Эндонуклеазы. Некоторые эндонуклеазы гвдро-лизуют одноцепочечные молекулы ДНК примерно в тысячу раз быстрее, чем двухцепочечные. Такая специфичность используется во многих экспериментах-при конструировании рекомбинантных ДНК, при гетеродупле КС ном анализе и даже при анализе экспрессии генов. Некоторые реакции, катализируемые подобными эндонуклеазами, представлены на рис. 4.2. [c.212]

Эндонуклеазы типов I и II. Ферменты, относящиеся к фуппе эндонуклеаз типов I и II,— это сложные белки, обладающие активностями рестриктирующей эндонуклеазы и метилазы. Эти интересные ферменты не используются, однако, при конструировании рекомбинантных молекул ДНК. Ферменты типа I связываются с ДНК в специфических участках и затем производят двух цеп очечные разрезы на разном расстоянии от сайтов узнавания, варьирующем от 400 п.н. до 7 т.п.н. Для осуществления ферментативного гидролиза ДНК необходимы АТР и 8-аденозилметионин. Последний активирует фермент. Разрезание сопровождается гидролизом АТР, при этом фермент утрачивает эндонуклеолитическую активность, но сохраняет АТРаз-ную. Таким образом, эндонуклеазы типа I являются ДНК-зависимыми АТРазами. Кроме того, они [c.214]

Эндонуклеазы типа II. Рестриктирующие эндонуклеазы типа П являются основным инструментом при конструировании рекомбинантных молекул ДНК и при анализе структуры ДНК. Эти ферменты способны узнавать специфические короткие нуклеотидные последовательности и связываться с ними, но в отличие от эндонуклеаз типов I и III они производят двухцепочечные разрезы по специфическим фосфодиэфирным связям либо в пределах самого сайта узнавания, либо на вполне определенном небольщом расстоянии от него. Один и тот же фермент разрезает данную молекулу ДНК с образованием одинаковых наборов фрагментов. Длина фрагментов определяется расстоянием между специфическими последовательностями, узнаваемыми этим ферментом. Ферменты типа II гидролизуют фосфоди эфирные связи между З -гидрою ильной Фуппой и фосфатом, в результате чего образуется 5 -фосфомоноэфирная группа с одной стороны от разрыва и 3 -гидроксильная фуппа—с другой. Для функционирования ферментов необходим двухва- [c.215]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология