Комплементационный анализ

Изучение г//-мутаций предоставило также генетические свидетельства в пользу существования кодонов, терминирующих синтез полипептидной цепи. Комплементационный анализ показал, что цистроны А и В кодируют две различные генетические функции. Это значит, что на границе между этими цистронами должны находиться определенные генетические знаки препинания . Делеция такого пограничного участка приводит к слиянию неделетированных участков Л и В в один общий цистрон. Так, делеция 1589 (рис. 12.2) приводит к возникновению гПА-мутанта, сохраняющего, несмотря на частичную делецию в В-цистроне, его функциональность, т.е. способность кодировать активный В-белок. Участок В-цистрона, исчезающий при делеции 1589, содержит ту самую область, в которой картируются мутации F O и ее производные. Это подтверждает сделанный в предыдущем разделе вывод о том, что данный участок В-белка не существен для проявления нормальной активности. Введение мутации со сдвигом рамки в неактивный Л-участок слитых цистронов, образовавшихся в результате делеции 1589, нарушает и функциональную активность В-участка. Следовательно, слитая мРНК имеет направление трансляции Л -> В считывание этой мРНК приводит к образованию одного слитого полипептида. [c.74]

Комплементационный анализ у высших эукариот [c.176]

Некоторые изменения в организации и изложении материала по сравнению с первым изданием начинаются уже в первой части. Раздел о составлении хромосомных карт у эукариот (глава 5) был переписан и расширен в соответствии с замечаниями преподавателей и наших собственных студентов. Новая глава 6 посвящена комплементационному анализу и изучению тонкой структуры гена как у прокариот, так и у эукариот. Глава, в первом издании шедшая под номером девять, (Репликация, репарация и рекомбинация ДНК) превратилась в главы 13 и 14, перенесенные во вторую часть, поскольку акцент смещен на функционирование генов, обеспечивающих процессы репликации и рекомбинации ДНК. Новая глава 9 Методы работы с ДНК завершает первую часть, поскольку вопросы конструирования рекомбинантных ДНК и анализа последовательности нуклеотидов в ДНК, строго говоря, относятся к теме Организация и передача генетического материала . Главы 6 и 7 были дополнены новыми появившимися в последние годы данными и получили в этом издании номера 7 и 8 соответственно. Значительная часть материала, входившего ранее в главу 8, в этом издании помещена в главы 6 и 14. [c.8]

В географически сильно разобщенных природных популяциях мы-щей было обнаружено большое число Г-мутаций. Комплементационный анализ рецессивных летальных Г-мутаций, проводимый путем скрещивания различных сбалансированных линий (рис. 6.14), показал, что в некоторых комбинациях потомство жизнеспособно и обладает нормальными хвостами, в других гибнет на эмбриональной стадии. Известные летальные Г-мутации распадаются на шесть групп комплементации (табл. 6.3). Гетерозиготные комбинации мутаций, относящихся к одной группе комплементации, детальны, тогда как двойные гетерозиготы по рецессивным деталям, относящимся к разным группам комплементации, жизнеспособны. [c.179]

Тест на комплементарность особенно удобен при анализе рецессивных летальных мутаций. Комплементационный анализ оказался решающим методом при исследовании мутаций локуса Т у мыши, поскольку многие из мутаций этого локуса подавляют рекомбинацию в участке хромосомы, в котором они находятся, делая таким образом рекомбинационный анализ невозможным. Доминантная мутация, называемая Bra hyrury T), возникает спонтанно в лабораторных линиях и легко выявляется, поскольку гетерозиготные мыши (Т/ Ч- ) имеют короткий хвост. Гомозиготы (Т/Т) погибают на эмбриональной стадии развития. Вскоре после открытия этой мутации обнаружилось, что некоторые линии, обладающие близким к дикому типу фенотипом, являются носителями рецессивных мутаций, обозначенных буквой t. При скрещивании таких линий с гетерозиготами Т/ + потомство получается бесхвостым (рис. 6.13). Эти t-мутации представляют собой рецессивные летали (рис. 6.14). Изображенное на рисунке скрещивание дает чистую линию T/t, поскольку, Ьо-первых, лишь мыши с этим генотипом выжи- [c.177]

Раздел 6. РЕКОМБИНАЦИОННЫЙ И КОМПЛЕМЕНТАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ [c.62]

Комплементационный анализ мутации в области гП фага Т4 [c.62]

Комплементационный анализ мутантов дрозофилы [c.63]

Комплементационный анализ мутаций гП области фага Т4 [c.64]

Благодаря созданию клонирующих векторов, способных реплицироваться и стабильно поддерживаться в разных грамотрицательных бактериях, появилась возможность получать библиотеки генов изучаемых бактерий, проводить молекулярно-генетические исследования организации и функционирования хромосомных и плазмидных генов, а также координируемо регулируемых наборов генов (оперонов). С помощью комплементационного анализа удается выявлять гибридные молекулы ДНК, несущие определенные локусы бактериальной хромосомы. При этом комплементация функций возможна и в неродственных, но относительно хорошо изученных бактериях. Рассмотрим некоторые исследования такого типа. [c.228]

Использование бензеровского комплементационного анализа для других участков генома Т-четных фагов показало, однако, что получаемые результаты не всегда столь однозначны, как это было при исходном определении генов А и В в области гН. Распределение ат-мутантов по генам было однозначным, однако Эдгар и Эпштейн обнаружили ряд 1з-щ-таций, которые, судя по их положению на генетической карте и по результатам функционального цис-транс-теста с тесно сцепленными ат-иу-тантами, должны относиться к одному и тому же гену, но тем не менее дают в цис-транс-тесте хорошую комплементацию. Аналогичные случаи внутригенной комплементации были вскоре обнаружены в работах по установлению генетической единицы функции в геноме бактерий и других организмов. [c.314]

Существуют два способа изучения роли отдельных компонентов репликации in vitro. Первый способ заключается во фракционировании системы, очистке компонентов и повторном их объединении. В другом случае используют мутант dna и эксперимент осуществляют при условиях, когда продукт мутантного гена неактивен. Затем проверяют экстракты из клеток дикого типа на их способность восстанавливать активность этой системы. Такой комплементационный анализ in vitro может быть использован при очистке белка, кодируемого локусом dna. [c.421]

До сих пор мы говорили о репликации ДНК, касаясь круга вопросов, связанных с движением репликационной вилки. Наличие мутантов с задержкой или прекращением синтеза ДНК свидетельствует об участии в ней генов, контролирующих другие функции. Мутации в четырех из них-39, 52, 58 и 60-определяют задержку синтеза ДНК. С помощью комплементационного анализа в системе in vitro показано, что продукты генов 39 и 52 связываются с другим белком (неизвестной природы) и образуют ком- [c.428]

Комплементационный анализ г//-мутантов легко проводится с помощью так называемого spot-me ma. Клетки, инфицированные гП-му-тантом с множественностью 0,1 (примерно один фаг на десять бактериальных клеток) смешиваются с теплым расплавленным агаром, и смесь наносится на поверхность питательной среды в чашке Петри. Когда агар затвердевает, на его поверхность капают несколько капель среды, содержащей другой г//-мутант. В месте падения капель некоторые клетки инфицируются обоими мутантами. Если при этом происходит комплементация, то в инфицированных клетках возникает потомство фагов обоих родительских генотипов (а также рекомбинантных генотипов). Это потомство инфицирует затем все остальные бактериальные клетки в покрытом каплей участке и убивает их. Таким образом, комплементация проявляется в лизисе бактерий на месте капли (рис. 6.7). [c.166]

Комплементационный анализ условно летальных мутаций фага 0 Х174 [c.195]

Комплементационный анализ перечисленных в табл. 7.2 мутантов показывает, что они относятся к восьми различным группам комплементации. Так, например, при заражении непермиссивных бактерий фагами ami О (цистрон D) и ат9 (цистрон G) их клетки лизируются, и, следовательно, потомство фагов возникает. Напротив, при заражении непермиссивного хозяина фага ат9 и ат32 потомство не возникает, и, следовательно, эти две мутации относятся к одной и той же группе комплементации (цистрон G). Если считать, что частота возникновения мутаций во всех генах примерно одинакова, то из факта, что в большинстве групп комплементации локализовано по нескольку мутаций, по-видимому, следует, что все эти мутации в совокупности затрагивают все важные гены фХ174. Другими словами, исследовано достаточное количество независимых мутаций для построения генетической карты. Далее мы увидим, что такое разделение на группы комплементации правильно отражает (за единственным исключением) механизм биохимического функционирования фага. [c.195]

Возможность гибридизации соматических клеток позволяет исследовать межгенную и внутригенную (межаллельную) комплементацию. Выживание гибридов на селективной среде при попарной гибридизации мутантов с одинаковым фенотипом, будет свидетельствовать о наличии комплементации. Очевидно, в таком случае одинаковый фенотип контролируется разными генами, ответственными за разные звенья биосинтеза, определяющего данный фенотип. Отсутствие комплементации будет наблюдаться в том случае, если изучаемый фенотип зависит от действия одного и того же гена. Впервые комплементационный анализ был проведен на мутантах, ауксотрофных по глицину, а позднее на ауксотрофах по пуринам в клетках китайского хомячка СНО-К1, у которых было выявлено 9 групп комплементации (Риск, Као, 1982). Межаллельная комплементация по гену ГФРТ была детально изучена в Лаборатории генетики соматических клеток Института молеку- [c.253]

При передаче F -элемента F -клеткам возникает так называемая частичная диплоидностъ. Такая частичная диплоидность позволяет осуществлять комплементационный анализ различных мутантов и выявлять доминантность или рецессивность различных аллелей определенных генов. Примеры использования результатов таких исследований приводятся в гл. 15. [c.240]

Многие белки представляют собой олигомеры, т. е. состоят из двух или нескольких идентичных полипептидных цепей, взаимодействующих между собой с образованием функционально активной четвертичной белковой структуры. В простейшем случае это-димер (аг), состоящий из двух одинаковых субъединиц (а). Это обстоятельство может осложнять комплементационный анализ мутантных структурных генов, кодирующих такие белки. Ранее при обсуждении опытов по комплементации мы исходили из того, что комплементация невозможна при наличии в диплоиде двух гетероаллельных мутаций, вызывающих различные аминокислотные замены, каждая из которых независимо инактивирует соответствующий полипептид (см. главу 6). Для примера рассмотрим случай, когда оба мутантных аллеля, т и Ш2, в условиях гомозиготно-сти приводят к некоторому мутантному фенотипу (например, к отсутствию определенной ферментативной активности). На основании сформулированных ранее представлений следовало бы полагать, что поскольку обе мутации затрагивают один и тот же ген, то и двойные гетерозиготы типа т +1 + т также будут иметь мутантный фенотип. В большинстве случаев, в том числе и для генов, кодирующих олигомерные белки, это действительно так. В то же время известно и доста- [c.30]

Первые указания на то, что в системе репликации ДНК участвует целый ряд важных генетических функций, были получены благодаря выделению широкого набора условно-летальных температурочувствительных мутантов Е. соН (dna ), комплементационный анализ которых позволил соотнести их с мутациями в ряде различных генов. Среди них можно выделить два класса мутантов, которые при рестриктивной температуре (1) немедленно прекращают синтез ДНК или (2) в течение относительно протяженного временного интервала постепенно прекращают синтезировать ДНК (рис. 13.5). Первый фенотип связан с нарушением процесса синтеза ДНК в репликативной вилке, а второй-с исчезновением способности инициировать новый цикл репликации хромосомы. (В несинхронизированной культуре индивидуальные клетки мутантов второго класса, находящиеся на различных стадиях репликации, начавшейся еще при пермиссивной температуре, не прекращают синтезировать ДНК после повышения температуры до полного завершения цикла репликации хромосомы.) После сопоставления выделенных мутаций с определенными белками, на которых сказываются эти мутации, можно начать изучение функциональной роли этих белков in vivo. Локализация генов, ответственных за репликацию ДНК, на хромосоме Е. соИ показана на рис. 13.6. [c.112]

Синхронная индукция всех трех белков реализуется через синтез одной общей полицистронной мРНК. Обычно в отсутствие индуктора уровень транскрипции генов la очень невелик и в клетке имеются лишь очень малые количества Р-галактозидазы и пермеазы. В то же время удается легко отобрать мутанты (так называемые конститутивные мутанты), которые и в отсутствие индуктора продуцируют большие количества этих белков, такие же, как нормальные клетки в условиях индукции. Все эти конститутивные мутанты содержат мутации вблизи гена Z и на достаточном удалении от генов Y н А. Как показал комплементационный анализ, такие мутанты можно разбить на два класса I " (не-индуцибельные) и 0° (операторно-конститутивные). С использованием элементов F la или конъюгативных мерозигот (см. гл. 8) можно получить частичные диплоиды, включающие такие мутации. Фенотипические проявления частичных диплоидов этого типа свидетельствуют, что мутации I и О оказывают принципиально различное влияние на синтез Р-галактозидазы. Из перечисленных в таблице 15.1 частичных диплоидов два первых характеризуются нормальным индуцибельным фенотипом, что указывает на рецессивный характер мутации 1 . Ген I осуществляет нормальный контроль экспрессии гена Z в случае обоих частично диплоидных генотипов независимо от того, находится ли ген Z на той же хромосоме, что и I, или на другой. В случае двух по- [c.173]

Дополнительная трудность комплементационного анализа возникает из-за супрессии ts-фенотипа другим сегментом, предположительно кодирующим белок, который дополняет функциональный деф зкт в сегменте, несущем ts-повреждение. Подобная экстраген-ная супрессия впервые была замечена у ts-мутантов реовируса [201] сейчас имеется несколько примеров и с мутантами вируса гриппа. М. Tolpin и соавт. [267] обнаружили, что мутация в гене РА рекомбинантного штамма вируса гриппа человека подавляет экспрессию 18 фенотина гена РВ2. Этот пример супрессорной [c.195]

При работе с клеточными гибридами возникает необходимость, с одной стороны, уметь отбирать гибриды, и с другой — их идентифицировать. Наиболее простой комплементационный анализ включает в себя слияние клеток, различающихся по единичным мутациям. Так, если клетки, нуждающиеся для роста в глицине (gly), слить с клетками, нуждающимися для роста в гипоксантине (hyp ), то, если мутации рецессивные, гетерока-рионы смогут расти в среде, лишенной одновременно и глицина и гипоксантина. Это можно использовать для отбора продуктов слияния. [c.190]

Главное преимущество фазмид — относительная простота комплементационного анализа. Действительно, как уже отмечалось, первичное клонирование больших фрагментов ДНК удобно проводить на фаговых векторах, а комплементационный анализ, реорганизацию фрагментов — с использованием плазмидных векторов. Фазмиды дают уникальную возможность отказаться от переклонирования генов из фаговых в плазмидные ве.кторы, а вместо этого применять для комплементационного анализа первич- [c.151]

Как индуцировать мутации в фаге К гидроксиламином in vitro указано в методике 8. Это весьма обычный метод мутаге-низирования как фага, так и выделенной в очищенном виде ДНК. Его преимущество заключается в высокой специфичности (индуцируются транзиции G—>-А) и большой эффективности. При работе с умеренным фагом контролировать эффективность мутагенеза очень просто — достаточно следить за появлением среди выжившего фага мутаций, приводящих к образованию прозрачных бляшек. По этой методике можно выделить амбер-мутантов фага К. С помощью спот-теста на комплементацию (методика 10) их можно охарактеризовать по их комплементации с амбер-мутациями в большинстве известных генов фага Л. Комплементационный анализ позволит определить положение полученных мутаций на карте. Мутации по ТЕМ-р-лактамазе можно использовать для картирования делеционных мутантов в этой модели клонированного фрагмента (эксперимент 6). [c.36]

Чтобы изучить процесс репликации альфавирусной РНК, проведены многочисленные исследования с использованием температурочувствительных мутантов по синтезу вирусных РНК. На основе данных генетического комплементационного анализа и исследования различных видов РНК, выделенных из клеток, зараженных этими мутантами, постулировано наличие четырех различных функций [84, 85]. Комплементационные группы А и G связываются с синтезом плюс-цепей 49S- и 26S-PHK. Однако мутанты группы А также дефектны по нормальному отключению синтеза минус-цепей 49S-PHK [70], и, кроме того, в них накапливается неструктурный полипротеин с мол. массой 200К [10]. Мутанты комплементационных групп В и F прекращают образование минус-цепей 49S-PHK при переносе в условия с непермиссивной температурой. У мутантов группы F синтез плюс-цепей 49S- и 26S-PHK также останавливается предполагают, что белок, дефектный у этих мутантов, имеет полимеразную активность (участвующую в элонгации). Функция, дефектная у мутантов группы В, связана с синтезом минус-, но не плюс-целей РНК, и соответствующий генный продукт лабилен [69]. [c.352]

Мухи с делецией по кодирующему эту ФДЭ району 3D4 характеризуются в 2-7 раз более высоким уровнем цАМФ по фавнению с мухами дикого типа. Было получено несколько мутантов по гену dun e и с помощью комплементационного анализа выявлено шесть аллелей этого локуса с разным уровнем ФДЭ-П. [c.244]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология