Белоксинтезирующие системы бесклеточные

Направление считывания мРНК — считывание генетического текста в процессе биосинтеза полипептидной цепи белка, начиная с 5 -конца полинуклеотидной цепи и кончая З -концом. Например, если в качестве матричной РНК в бесклеточной белоксинтезирующей системе используется гексануклеотид, А—А—А—У—У—У, то ос-новнмм продуктом реакции является дипептид Лиз—Фе. А когда в качестве мРНК используются полинуклеотиды со структурой А—А—А......А—А—Ц, то среди продуктов обнаруживаются олигопептиды со структурой Лиз—Лиз—Лиз.....Лиз—Асп [c.61]

Неоднозначность кода — способность триплета кодировать более чем одну аминокислоту. Например, поли-У в бесклеточной белоксинтезирующей системе направляет [c.61]

БЕСКЛЕТОЧНАЯ БЕЛОКСИНТЕЗИРУЮЩАЯ СИСТЕМА ИЗ КЛЕТОК АСЦИТНОЙ КАРЦИНОМЫ [c.358]

Стабильные клетки-продуценты, созданные на основе амплификации рекомбинантных генов, позволяют получать рекомбинантные продукты в более высоких титрах по сравнению с клетками, адаптированными к быстрой кратковременной экспрессии рекомбинантных белков (клетки MEL или OS). Для получения высокого уровня экспрессии рекомбинантных белков во всех обсуждаемых системах необходимо, прежде всего, учитывать особенности структуры белка, который должен быть синтезирован, и конструировать экспрессирующие векторы в соответствии с требованиями, предъявляемыми теми или иными клетками. В ряде случаев предварительные исследования такого рода бывает удобнее провести в бесклеточных белоксинтезирующих системах, которые позволяют иногда получать даже препаративные количества рекомбинантных белков. [c.183]

Бесклеточные белоксинтезирующие системы [c.185]

Из-за высокой стоимости очищенных компонентов в подавляющем большинстве случаев бесклеточные системы биосинтеза белка используют в аналитическом варианте, когда объем пробы не превышает 100 мкл. Однако в последнее время разработаны проточные белоксинтезирующие системы, в которых процесс трансляции удается поддерживать длительное время, непрерывно подводя извне расходуемые вещества, с одновременным удалением синтезируемых белков и продуктов деградации компонентов системы. Основные принципы получения и функционирования всех разновидностей белоксинтезирующих систем будут рассмотрены ниже. [c.186]

Несмотря на то, что в бесклеточной трансляции чаще всего находят применение системы с использованием 830- и 8100-экстрактов с добавленными рибосомами, современный уровень знаний молекулярных механизмов трансляции позволяет получать бесклеточные белоксинтезирующие системы из полностью очищенных компонентов. Однако создание таких систем является трудоемким процессом, поэтому их применяют только в аналитическом варианте для решения специальных задач. [c.189]

Функционирование системы из зародышей пшеницы и ее состав существенно не отличаются от таковых ретикулоцитарной системы биосинтеза белка. Различия заключаются, главным образом, в методах получения бесклеточных экстрактов. Зародыши обычно выделяют из сухих зерен озимой пшеницы. Преимуществами этих бесклеточных белоксинтезирующих систем перед другими являются возможность длительного хранения и доступность исходного биологического материала (зерен сортовой пшеницы), что обеспечивает воспроизводимость получаемых результатов и не требует проведения экспериментов с лабораторными животными. [c.190]

Универсальность кода. Было показано, что почти все 64 триплета при их испытании в бесклеточных системах несут какую-то смысловую нагрузку. Это делает естественным предположение, согласно которому какие-то черты генетического кода носят универсальный характер. Более того, гетерологич-ные бесклеточные системы (т. е. системы, содержащие рибосомы из организма одного вида, а транспортные РНК и активирующие ферменты — из организма другого вида) способны синтезировать полипептиды так же эффективно, как и соответствующие гомологичные системы, что опять-таки свидетельствует об универсальности кода. Имеются также косвенные данные, говорящие о том, что смысл данного кодона сохраняется неизменным для разных систем. Наконец,, было показано, что белоксинтезирующая система из Е. olt способна транслировать информацию, содержащуюся в РНК из вируса растений. Данные, полученные в опытах на Е. oli и других бактериях, на вирусах, дролоках, проростках растений, ретикулоцитах кролика, печени крысы, гемоглобине человека и т. д., убедительно подтверждают предполо- [c.499]

Как видно из фиг. 218, все такие цепочки содержали только А, и лишь на З -конце каждой из них находился остаток Ц. Другими словами, средняя цепочка длиной в 21 нуклеотид содержала последовательность из шести кодонов ААА и заканчивалась кодоном ААЦ. Эти цепочки были использованы в качестве искусственных мРНК в бесклеточной белоксинтезирующей системе. Как и следовало ожидать на основании кода (табл. 27), в котором ААА и ААЦ определяют соответственно лизин и аспарагин, в системе синтезировались полипептиды, содержащие эти две аминокислоты, причем лизин встречался гораздо чаще. [c.444]

Третья часть книги включает некоторые методы исследования белоксин-тезирующей системы животных клеток. В нее входят среди других такие методы, как метод определения времени синтеза полипептидной цепи, иммуно-химический метод выделения индивидуальных полирибосом. Описаны также две бесклеточные белоксинтезирующие системы. [c.2]

Нарушение процесса трансляции может быть обусловлено повреждением одного или многих компонентов белоксинтезирующей системы. Чтобы выяснить это, используют три типа бесклеточных систем синтеза белка 1) нефракционированную (грубую) систему, содержащую постмитохондриальную или постмикросомную надосадочную жидкость и необходимые добавки, 2) систему, реконструированную из полирибосом и клеточного сока, и 3) систему, стимулируемую добавлением тРНК (Abakumova Н др., 1974). [c.287]

Среди искусственных систем биосинтеза белка важное место занимают бесклеточные системы [260]. Любая бесклеточная система создается, прежде всего, для моделирования конкретных биохимических процессов, происходящих в живом организме, и во время функционирования воспроизводит некоторые существенные особенности жизнедеятельности клетки. В генной инженерии бесклеточные белоксинтезирующие системы часто используются для исследования кодирующего потенциала и механизмов экспрессии клонированных генов in vitro, а также на промежуточных этапах конструирования рекомбинантных генов для идентификации мРНК или фрагментов ДНК по кодируемым белкам. [c.185]

В некоторых бесклеточных системах транслируют предварительно очищенную мРНК или используют эндогенную мРНК, присутствующую в полисомах. В других белоксинтезирующих системах - системах сопряженной транскрипции и трансляции, одновременно происходят синтез мРНК и ее трансляция рибосомами. [c.186]

Все основные компоненты, необходимые для функционирования бактериальных бесклеточных систем биосинтеза белка, должны присутствовать и в бесклеточной белоксинтезирующей системе из ретикулоцитов кроликов. Однако необходимо отметить две существенные особенности такой системы. Во-первых, для регенерации АТР в качестве доноров фосфатных групп используют креатинфосфат - универсальный аккумулятор энергии в макроэргических связях у большинства позвоночных, а сам перенос групп осуществляется вводимой в систему креатинфосфо-киназой. Во-вторых, для предотвращения ингибирования трансляции в процессе синтеза белка в систему вводят гемин. [c.190]

Несмотря на то, что разные эукариотические бесклеточные белоксинтезирующие системы активно транслируют гетерологичные мРНК, гомологичные матрицы, как правило, транслируются более эффективно. Например, глобиновые мРНК используются в синтезе белка в семь-восемь раз лучше лизатами ретикулоцитов, чем экстрактами культивируемых клеток яичников китайских хомячков. Кроме того, в клетках разных типов дифференцированных тканей могут присутствовать специфические белковые ингибиторы трансляции определенных мРНК. Факты такого рода необходимо учитывать при выборе бесклеточной системы для решения конкретных экспериментальных задач. [c.190]

С разработкой проточной бесклеточной белоксинтезирующей системы стало возможным проводить биосинтез рекомбинантных белков в препаративных количествах in vitro. Такая система позволяет синтезировать в больших количествах полипептиды, подверженные быстрой внутриклеточной деградации про-теиназами или образующие тельца включения в живых клетках. Проточная система может быть полезна также для получения белков, обладающих цитотоксической активностью, или других рекомбинантных полипептидов, для которых нежелательны артефактные посттрансляционные модификации, происходящие in vivo. Недавно в таких системах удалось получить препаративные Количества функционально активного интерлейкина 6 человека. [c.191]

Обработка интерфероном приводит к индукции или подавлению синтеза многих белков. Некоторые белки индуцируются любыми интерферонами [88], другие — интерферонами лишь какого-нибудь одного класса [201]. Например, -ИФН индуцирует синтез нескольких белков в дополнение к тем, которые индуцируются также а-ИФН и -ИФН [264]. Можно также легко показать, что обработка интерфероном всех трех классов запускает синтез новых уникальных видов мРНК, которые обнаруживаются в течение первых 40 мин, накапливаются в течение 2 ч и затем в течение нескольких (до 16 ч) часов остаются связанными с рибосомами [41]. При трансляции этих мРНК в бесклеточной белоксинтезирующей системе происходит синтез нескольких новых белков. Пока идентифицированы лишь немногие из них. К наиболее хорошо изученным относятся 2,5-oligo (А)-синтетаза и протеинкиназа, обсуждавшиеся выше. В нормальных тканях уровень этих ферментов варьирует, но в обоих случаях при об- [c.68]

Связанное с полиовирусной инфекцией снижение синтеза белков клетки-хозяина [240] сопровождается диссоциацией комплексов рибосом с мРНК. Распад полисом не связан с деграда-цией молекул хозяйской мРНК, поскольку после выделения из зараженных клеток они сохраняют полную активность в бесклеточной белоксинтезирующей системе [154]. [c.226]

Самую большую трудность представляло выяснение последовательности нуклЁотидов в кодонах, определяющих положение аминокислоты в белковой молекуле ведь при известном качественном составе кодона оставалось неясным, какое же чередование нуклеотидных остатков в нем (например, АЦУ, ЦАУ, У Ц, АУЦ, ЦУ или УЦА) действительно кодирует данную аминокислоту при биосинтезе белка в рибосоме. Но и эта трудность была преодолена после того, как было обнаружено, что синтетические трину-клеотиды, подобно мРНК, могут специфически связывать аминоацил-тРНК с рибосомами, а в лаборатории Г. Корана были синтезированы поли-рибонуклеотиды заданного строения (с известной последовательностью нуклеотидных остатков) и применены для экспериментального выявления в бесклеточных белоксинтезирующих системах первичной структуры кодонов для каждой аминокислоты. [c.297]

Так как ложное кодирование очень сильно зависит от целого ряда как внешних, так и структурных факторов, то очевидно, что в бесклеточных системах его уровень может варьировать в чрезвычайно широких пределах. Поэтому важно оценить, каков естественный уровень ложного кодирования в нормальных живых клетках, не подвергаемых тем или иным экстремальным воздействиям и не содержащих мутационных нарушений белоксинтезирующего аппарата. Однако оценить это нелегко по ряду причин. Во-первых, на стадиях, предшествующих связыванию аминоацил-тРНК, тоже возможны ошибки, например, ложное ацилиро-вание тРНК оно будет завышать оцениваемый уровень ложного кодирования. Во-вторых, на стадиях после связывания аминоацил-тРНК и включения ложной аминокислоты в пептидную цепь возможна элиминация ложного продукта — либо путем аборта растущего пептида, либо путем переваривания окончательного неправильного белкового продукта. В-третьих, если готовый неправильный продукт обладает другими свойствами, чем правильный, то он может не встраиваться в те структуры, в которых мы его ищем, или не выделяться теми процедурами, которые мы используем для данного белка. Два последних обстоятельства будут занижать оцениваемый уровень ложного кодирования, и могут занижать его сильно. [c.172]

В ряде лабораторий (в частности, в лаборатории С. Бреннера) были получены данные о возможности существования в клетках в соединении с рибосомами короткоживущей РНК, названной информационной (иРНК). Сейчас она обозначается как матричная РНК (мРНК), потому что ее роль заключается в переносе информации от ДНК в ядре (где она синтезируется под действием ДНК-зависимой РНК-полимеразы) до цитоплазмы, где она соединяется с рибосомами и служит матрицей, на которой осуществляется синтез белка. Эта блестящая гипотеза затем экспериментально бьша доказана в лаборатории М. Ниренберга. При изучении влияния различных фракций клеточной РНК на способность рибосом, выделенных из Е. oli, к синтезу белка было установлено, что некоторые из них стимулировали включение С-аминокислот в синтезируемый полипептид. Добавление синтетического полинуклеотида, в частности полиуридиловой кислоты (поли-У), в белоксинтезирующую систему приводило к включению в синтезирующуюся белковую молекулу единственной аминокислоты -фенилаланина. Поли-У вызывал синтез в бесклеточной системе необычного полипептида полифенилаланина. Таким образом, искусственно синтезированный полирибонуклеотид, добавленный к препаратам рибосом, включавшим известные к тому времени факторы белкового синтеза и источники энергии, вызывал синтез определенного, запрограммированного полипептида. [c.519]

Определить порядок оснований в триплете — задача нелегкая. Один из подходов заключается в следующем [61]. В качестве затравки для полипуклеотидфосфорилазы используют динуклеотид фАфУ, а в качестве субстрата — УДФ. Полученный полимер фАфУфУфУ...фУфУ содержит на одном конце цепи триплет АУУ. 13 белоксинтезирующей бесклеточной системе этот полимер образует продукт, состоящий преимущественно из фенилаланина с небольшой примесью тирозина. Следовательно, тирозин кодируется триплетом АУУ в указанной последовательности. Точно таким же путем можно показать, что триплетом для цистеина является последовательность ГГУ. [c.275]

Из 50—60 г ткани можно выделить 100—120 мг очищенных полирнбосом (свободные+связанные). Соотношение выхода свободных и связанных с мембранами цитоплазматической сети полирибосом зависит от объекта. Из печени крыс, например, выделяют приблизительно равные количества свободных и связанных полирнбосом (Егкеп, 1973). Суспензии полирибосом могут храниться при —20 С до 2 дней без потери белоксинтезирующей активности в бесклеточной системе. [c.303]

Для функционирования бесклеточных белоксинтезирующих систем необходимо обеспечивать в них определенные ионные условия. Наиболее существенным фактором в этом случае является концентрация ионов Mg2+. Достаточно изменения оптимальной концентрации Mg2+ в системе на 1-2 мМ, чтобы в ней перестали синтезироваться полипептиды, обладающие ферментативной активностью. При этом влияние ионов Mg2+ на суммарное включение аминокислот в синтезируемые полипептидные цепи проявляется в меньшей степени, что, по-видимому, объясняется нарушением точности включения аминокислот в белки при неоптимальных концентрациях ионов Mg2+. В системах in vitro ионы Mg2+ могут быть заменены на ионы Са + и даже Мп2+, а также частично замещены полиаминами спермидином или спермином, которые благоприятно влияют на трансляцию и образование нативных белков. [c.188]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология