Хроматография белков на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой

Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе. ДЭАЭ-целлюлозу подготавливают в соответствии с инструкцией (с. 109), заполняют колонку (3x25 см) и уравновешивают буфером (реактив № 2). Наносят раствор белка и проводят элюцию в линейном градиенте того же буфера, содержащего О—0,3 М КС1. Скорость элюции — 90 мл/ч. Собирают фракции по 9 мл, определяют в них содержание белка и ферментативную активность. Фракции, в которых обнаружена активность гексокиназы, объединяют и проводят повторную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе. Для этого подготавливают колонку размером 1,4X15 см. Белок элюируют буфером (реактив 2) (около 200 мл), содержащим О—0,3 М КС1. Скорость элюции — 35 мл/ч. Собирают фракции по [c.218]

Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе рН-градиентная элюция. На колонку размером 1,2X27 см, заполненную ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную фосфатным буфером (реактив Л Ь 2), наносят раствор белка. Элюцию проводят в градиенте pH, используя 150 мл буфера (реактив № 2) в смешивающем сосуде, и 150 мл буфера (реактив № 4) во втором сосуде. На колонку можно нанести примерно 10 мг белка. Скорость элюции — 20 мл/ч. Собирают фракции по 4 мл. В процессе хроматографии pH изменяется от 7,0 до 5,0. Первым (после выхода из колонки примерно 100 мл раствора) выходит изозим I и вслед за ним — белок, соответствующий изозиму П. [c.219]

Очистка препарата тяжелого меромиозина с помощью ионообменной хроматографии. Для очистки фермента можно также воспользоваться методом колоночной хроматографии. Для этого супернатант после осаждения миозина и легкого меромиозина (15—30 мл) наносят на колонку (2x11 см) с ДЭАЭ-целлюлозой (ДЭАЭ-52, ватман), уравновешенную 50 мМ трис-НС1 буфером pH 7,9. После нанесения белка колонку промывают двумя объемами того же буфера. Белок элюируют линейным градиентом КС1 от О до 0,5 М (2x250 мл). [c.395]

В последние 10 лет в нескольких лабораториях были разработаны методы получения высокоочищенной карбоангидразы из эритроцитов [34—42]. Они заключаются в осаждении гемоглобина смесью хлороформ—этанол [37, 39, 42] с последующей хроматографией на колонке, заполненной ДЭАЭ-целлюлозой [34, 37, 42], ДЭАЭ-сефадексом [43] или гидроксилапатитом [37, 39, 42]. Белок хорошо переносит лиофилизацию, и в большинстве методов она используется на той или иной стадии выделения. Накопленный опыт препаративной работы выявил некоторые особенности методов очистки фермента. Обработка смесью хлороформ—этанол существенно не меняет большинство физико-химических свойств. Но, как показал рентгеноструктурный анализ, воздействие этой смеси на фермент С человека снижает качество кристаллов [22, 23]. Для удаления гемоглобина лучше использовать гель-фильтрацию [37] или хроматографию на ДЭАЭ-сефадексе [43]. Качество кристаллов повышается, если проводится электрофоретическая очистка фермента [23] и если не применяется лиофилизация [22, 23]. [c.562]

Рис. 4-46. Три типа матриксов, используемых для хроматографии. При ионообменной хроматографии (А) нерастворимый матрикс содержит ионы, задерживающие молекулы с противоположным зарядом. Для разделения молекул используются следующие матриксы диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза) - заряжена положительно карбоксиметилцеллюлоза (КМ-целлюлоза) и фосфоцеллюлоза - заряжены отрицательно. Силы взаимодействия между молекулами в растворе и ионообменником определяются ионной силой и pH элюирующего раствора, которые для достижения эффективного разделения можно варьировать определенным образом (как на рис. 4-47). При хроматографии по методу гель-фильтрапии (Б) матрикс инертен, но содержит поры. Низкомолекулярные соединения проникают внутрь частиц матрикса. Оказавшись при этом в относительно большем объеме, они проходят через колонку медленнее. В качестве матрикса можно использовать зерна поперечно-сшитого полисахарида (декстран или агароза). Поскольку в продаже имеются полисахариды с самым различным размером пор, их можно использовать для фракционирования молекул с молекулярной массой от 500 до 5 х 10 дальтон. При аффинной хроматографии (В) используется нерастворимый матрикс, ковалентно связанный со специфичными лигандами (антителами или субстратом ферментов), которые присоединяют определенный белок. Связываемые иммобилизованным субстратом молекулы фермента можно элюировать концентрированными растворами субстрата в свободной форме, а молекулы, связанные с иммобилизованными антителами, можно элюировать за счет диссоциации комплекса антитело антиген концентрированными растворами соли или растворами низкого или высокого pH. Однократная хроматография на такой колонке позволяет

Справочник химика 21

Химия и химическая технология