Белки методы нанесения

С помощью распределительной хроматографии легко осуществляется разделение аминокислот и определение их в-смеси. Метод заключается в том, что каплю смеси аминокислот или гидролизата белка наносят на полоску фильтровальной бумаги, конец которой опускают в подходящий органический растворитель. Растворитель насасывается полоской фильтровальной бумаги и увлекает за собой нанесенные на бумагу аминокислоты. Скорость перемещения аминокислот на бумаге зависит от химического строения аминокислот и от их способности растворяться в подвижном и неподвижном растворителе. В качестве подвижного растворителя употребляют, например, водонасыщенный фенол (или н. бутиловый спирт, амиловый спирт и др.). Неподвижным растворителем является вода, пары которой насыщают фильтровальную бумагу (внешне бумага остается сухой). Чем меньше растворимость аминокислот в воде и чем больше их растворимость в феноле, тем быстрее они движутся вслед за фронтом органического растворителя. [c.21]

Методы нанесения белковых пленок. Применяется два основных метода для нанесения пленок белков [c.254]

Электрокинетические явления находят практическое применение. Так, с помощью электрофореза проводят формование различных изделий из тонких взвесей с последующим их спеканием. Метод электрофореза щироко применяют для разделения, выделения и исследования биоколлоидов, особенно белков. Простой его вариант, называемый электрофорезом на бумаге, состоит в том, что нанесенное на полоску бумаги пятно исследуемой смеси белков разделяется на компоненты по величине их заряда, а следовательно, и скорости движения в поле постоянного электрического тока. Этим методом исследуют качественный и количественный состав белков крови и других биологических жидкостей. [c.308]

В общем смысле под иммуноблоттингом понимают анализ смеси белков, перенесенных на твердую подложку-мембрану, с которой они связываются ковалентными связями, с последующей иммунодетекцией. Анализировать можно смесь белков, непосредственно нанесенную на подложку, — дот-блот анализ (от англ. dot — пятнышко) — либо после ее предварительного фракционирования методами электрофокусирования, диск-электрофореза или двумерного электрофореза — Вестерн-блот анализ (Western blotting). Такая методология применяется также для отбора клонов бактерий, фагов или вирусов, экспрессирующих продукты целевых клонированных генов. Перенос белков на мембрану осуществляется либо пассивно, либо с использованием аппаратуры для электропереноса. На эффективность переноса белков на мембрану влияет множество факторов, таких как молекулярная масса белков, пористость геля, время переноса и состав используемого буферного раствора (транс-буфера). В зависимости от задач и условий проведения эксперимента подбираются условия переноса, обеспечивающие наилучшие результаты. [c.57]

Определение количества фосфорилазы а. Из реакционной смеси отбирают аликвоты и помещают их на диски фильтровальной бумаги (ватман 3 ММ). Белок, нанесенный на фильтры, фиксируют 20%-ным раствором трихлоруксусной кислоты, после чего фильтры тщательно отмывают от не связанной с белком радиоактивной метки несколько раз сменяемым раствором 5%-ной трихлоруксусной кислоты. Затем фильтры обрабатывают смесью абсолютного спирта и ацетона (1 1) и подсушивают в термостате при 70—80° С (или на воздухе). Сухие фильтры помещают во флаконы со сцинцилляционной жидкостью. Определение радиоактивности проводится методом жидкостной сцинцилляционной спектрометрии. [c.224]

Весьма ценной разновидностью обычной тонкослойной или бумажной хроматографии является диагональная хроматография. Сначала нанесенный материал хроматографируют в одном направлении, затем в тонком слое на пластинке или бумаге проводят определенную химическую реакцию, после чего осуществляют разделение в другом направлении. Немодифицированные соединения располагаются по диагонали пластинки, тогда как продукты реакции оказываются смещенными по отношению к ней. Этим методом исследовали фотохимические [149] и другие [147] реакции флавинов. Аналогичный диагональный электрофорез применялся для идентификации пар —8Н-групп, образующих в белках дисульфидные мостики [150]. Пептидные фрагменты, содержащие 8—8-мостики, разделяли с помощью электрофореза на бумаге, затем обрабатывали бумагу парами надмуравьиной кислоты, разрывающей мостики [уравнение (2-20)], и после электрофореза в перпендикулярном направлении опрыскивали бумагу нингидрином. Пятна, расположенные вне диагонали, соответствовали фрагментам, которые участвовали в образовании 8—8-мостиков. По положению пятен подбирали [c.180]

Принцип метода. Белки, нанесенные на смоченную буферным раствором ацетат-целлюлозную мембрану, мигрируют в электрическом поле в соответствии с общим зарядом их молекул. [c.71]

Метод иммуноэлектрофореза позволяет сравнивать между собой не только смеси белков (антигены) с помощью данной иммунной сыворотки, но также и иммунные сыворотки с помощью данного антигена. Для такого исследования в пластинке агарового геля вырезают две параллельные канавки, а между ними на расстоянии 3 мм от края каждой делают лунку для образца. В нее вносят раствор определенного белка и, проведя электрофорез, заполняют канавки сравниваемыми иммунными сыворотками. Полосы преципитации, которые появляются с обеих сторон от нанесенного образца, позволяют сопоставлять исследуемые иммунные сыворотки. [c.148]

В медицинских исследовательских лабораториях весьма необходимы простые и надежные микрометоды определения изменений в обмене веществ. Анализы следует проводить быстро и серийно. С зтой точки зрения оказался подходящим метод хроматографии на бумаге, нашедший применение в медицинских лабораториях сразу после того, как были успешно разделены смеси аминокислот. Ценным вспомогательным диагностическим средством при разделении ионогенных смесей оказался затем и электрофорез (ионофорез) на различных слоях носителей . Этот метод нашел широкое применение благодаря высокой эффективности процесса разделения белков. Для количественного расчета состава разделенных смесей, нанесенных в виде полос, используют регистрирующие фотоэлектрические приборы. [c.337]

Хотя деструкция часто является нежелательной побочной реакцией, ее нередко проводят сознательно для частичного снижения степени полимеризации, чем облегчаются переработка и практическое использование полимеров. Например, в производстве лаков на основе эфиров целлюлозы, когда непосредственное растворение этих веществ дает слишком вязкие растворы, неудобные для нанесения покрытий, исходную целлюлозу подвергают предварительной деструкции. Частичная деструкция (пластикация) натурального каучука на вальцах облегчает его переработку в резиновые изделия. Реакция деструкции используется для установления химического строения полимеров, для получения ценных низкомолекулярных веществ нз природных полимеров (гидролитическая деструкция целлюлозы или крахмала в глюкозу, белков в аминокислоты), при синтезе привитых и блок-сополимеров и т. д. Изучение деструкции дает возможность установить, в каких условиях могут перерабатываться и эксплуатироваться полимеры оно позволяет разработать эффективные методы защиты полимеров от различные воздействий, найти способы получения полимеров, которые мало чувствительны к деструкции, и т. д. Знание механизма и закономерностей деструкции дает возможность усилить или ослабить ее по желанию в зависимости от поставленной задачи. [c.621]

Тонкослойная хроматография появилась в то же время, когда хроматографическое разделение на пористых гелях стало стандартным лабораторным методом [84, 85]. Представлялось целесообразным объединить оба метода и сделать 1ем самым тонкослойную хроматографию пригодной для разделения высокомолекулярных соединений, и прежде всего белков. Соответствующие опыты были проведены с сефадексами различных типов. По существу слой набухшего сефадекса представляет собой открытый столбик геля, который отличается от носителя в колонке только тем, что он доступен для манипуляций (например, для нанесения образца или проявления зон). Обычно в тонкослойной хроматографии пользуются пластинками с нанесенным на них сухим носителем [84, 85] движение растворителя осуществляется за счет капиллярных сил при погружении пластинки (чаще [c.84]

Сущность метода заключается в том, что оба конца ленты фильтровальной бумаги, смоченные буфером, нужно опустить в буферный раствор, связанный с электродами. Исследуемый раствор нанести на бумагу в виде точки или полосы из нескольких капель. Аппарат (рис. 18) закрыть, чтобы препятствовать испарению тонкого слоя буферного раствора. Через несколько часов электрофореза (в зависимости от применяемой силы поля) белки под действием тока отходят от места их нанесения на не- [c.156]

Электрокинетические явления находят практическое применение. Так, с помощью электрофореза проводят формование различных изделий из тонких взвесей с последующим их спеканием. Метод электрофореза широко применяют для разделения, выделения и исследования биоколлоидов, особенно белков. Простой его вариант, называемый электрофорезом на бумаге, состоит в том, что нанесенное на полоску бумаги пятно исследуемой смеси белков [c.331]

Кисти. Нанесение лакокрасочных материалов кистью является старейшим методом, практически не претерпевшим изменений. Лучшим материалом для изготовления жестких малярных кистей является свиная щетина, для мягких (художественных) — шерсть колонка, белки. Свиная щетина от природы обладает конусообразной формой, имеет на конце раздвоение, что позволяет получать покрытие высокого [c.67]

Очистка препарата тяжелого меромиозина с помощью ионообменной хроматографии. Для очистки фермента можно также воспользоваться методом колоночной хроматографии. Для этого супернатант после осаждения миозина и легкого меромиозина (15—30 мл) наносят на колонку (2x11 см) с ДЭАЭ-целлюлозой (ДЭАЭ-52, ватман), уравновешенную 50 мМ трис-НС1 буфером pH 7,9. После нанесения белка колонку промывают двумя объемами того же буфера. Белок элюируют линейным градиентом КС1 от О до 0,5 М (2x250 мл). [c.395]

Для выявления молекул клеточной поверхности, участвующих в межклеточной адгезии, белки плазматической мембраны солюбилизируют, отделяют друг от друга и каждую фракцию испытывают на способность нейтрализовать действие фрагментов антител, блокирующее агрегацию клеток (этапы 3 и 4). Затем фракции, проявившие такую способность, очищают и вновь тестируют до тех пор, пока не будет получен чистый белок (этот процесс на схеме не показан). Другой Иммунологический подход состоит в получении большого числа моноклональных антител (разд. 4.5.4) к антигенам клеточной поверхности и их скрининге для выявления тех, которые будут блокировать межклеточную адгезию. Оба иммунологических метода основаны на важном общем наблюдении простое нанесение на клеточную поверхность антител само по себе не препятствует нормальной клеточной адгезии адгезия блокируется только тогда, когда мишенями для связывания антител служат специфические молекулы клеточной [c.518]

Отмывка сетки — полезная дополнительная процедура, следующая за нанесением суспензии, но предшествующая негативному контрастированию (в двухэтапном методе). Ее проводят для того, чтобы удалить остатки клеток, а также излишки солей и белка, выпадающие в осадок под действием некоторых красителей и ухудшающие изображение исследуемых компонентов. Отмывку проводят, быстро прикасаясь поверхностью сетки к капле воды, причем эту операцию повторяют несколько раз с новыми каплями дистиллированной воды или еще какой-либо жидкости. Другой способ отмывки заключается в том, что сетку препаратом вниз помещают на влажную поверхность полоски тонкой согнутой фильтровальной бумаги ватман № 1, которая через край впитывает отмывающую жидкость из маленького стаканчика или чашки Петри. В любом из этих случаев сетку окрашивают сразу же после удаления избытка жидкости фильтровальной бумагой. [c.102]

При своеобразном способе нанесения исследуемого материала на хроматографическую бумагу с помощью полиэтиленовой пленки дном нагретой на пламени стеклянной пробирки в пленке делают несколько углублений, в которые вносят примерно по 0,05 мл исследуемого материала, например кислотного гидролизата белка. На одной пленке можно разместить 3—5 проб (фиг. 39). Очень осторожно, остерегаясь размазать капли, пленку переносят для высушивания в вакуумный эксикатор. Примерно через 10—15 мин, когда капли подсохнут, пленку извлекают и на край каждого высохшего пятна наносят маленькую каплю воды заостренным концом стеклянной палочки, с помощью которой растворяют весь материал в этой капле. Лист хроматографической бумаги кладут на чистое стекло и отмечают карандашом места нанесения материала.Затем к этому участку бумаги прикладывают полиэтиленовую пленку с исследуемым материалом и с обратной стороны прижимают ее к бумаге пальцем. Если при этом площадь смоченной бумаги будет не больше 1 см , то в результате хроматографии исследуемый материал распределится небольшими пяхнами правильной формы. Этот метод нанесения обладает большими преимуществами в течение нескольких минут можно без потерь нанести 20—30 образцов. При этом отпадает необходимость готовить и мыть капилляры, применять при нанесении высушивание горячим воздухом и т. д. [c.190]

С помощью Л. X, удается выделять и разделять соед., склонные к координации с ионами металлов, в присут. больших кол-в минер, солей и некоординирующихся в-в. Напр, с использованием иминодиацетатной смолы с ионами Си из морской воды выделяют своб. аминокислоты На катионитах с ионами Ре разделяют фенолы, с ионами Лg -сахара. На карбоксильных катионитах с N1 разделяют амины, азотсодержащие гетероциклы, алкалоиды. На силикагеле с нанесенным слоем силиката Си в водно-орг. среде в присут. ННз проводят быстрый анализ смесей аминокислот и пептидов, причем элюируемые из колонки комплексы легко детектируются спектрофотометрически. На высокопроницаемых декстрановых сорбентах с иминодиацетатными группами, удерживающими ионы N1 или Си- , селективно выделяются из сложных смесей индивидуальные белки и ферменты, содержащие иа пов-сти своих глобул остатки гистидина, лизина или цистеина. Силикагели с фиксированными на пов-сти инертными т/)ис-этилендиа.миновыми комплексами Со используют для т. наз. внешнесферной Л. х. смесей нуклеотид-фосфатов. Методом газовой Л. х. с помощью фаз, содержащих соли Ag , разделяют олефины, ароматич. соед., простые эфиры. Тонкослойная Л. х. на носителях, пропитанных солями Ag , применяется для анализа стероидов и липидов. [c.590]

Практическое применение. Электроосмос используют для обезвоживания пористых тел - при осушке стен зданий, сыпучих материалов и т. п., а также для пропитки материалов. Все шире применяют электроосмотич. фильтрование, сочетающее фильтрование под действием приложенного давления и электроосмотич. перенос жидкости в электрич. поле. Использование электрофореза связано с нанесением покрытий на дета сложной конфигурации, для покрытия катодов электроламп, полупроводниковых деталей, нагревателей и т. п. Этот метод применяется также дня фракционирования полимеров, минеральных дисперсий, для извлечения белков, нуклеиновых к-т. Лекарств, электрофорез - метод введения в организм через кожу или слизистые оболочки разл. лек. средств. Эффект возникновения потенциала течения используется для преобразования мех. энергии в электрическую в датчиках давления. [c.430]

В настоящее время имеется ряд новых методов определения молекулярного веса, которые могут соперничать с ультрацентрифугированием. Один из них — это простая гель-фильтрация. Колонку тщательно заполняют гелем (например, сефадексом) и калибруют, пропуская ряд белковых растворов. Измеряют Уе — объем элюата, собранного с момента нанесения вещества на колонку до момента его выхода из колонки, и делят этот объем на Уо — объем элюата для очень крупных частиц, совершенно не проникающих внутрь частиц геля. Далее строят зависимость Уе/Уо ОТ логарифма мол. веса для ряда белков с известным молекулярным весом. Как и при оценке молекулярных весов по константам седиментации, здесь предполагается, что молекулы всех белков имеют примерно сферическую форму для неизвестного белка значение молекулярного веса определяют по местоположению отвечающей ему точки на описанном выше графике [153, 154]. Модификацией этого метода служит хроматография при высоких концентрациях гуанидинхло-рида — соли, вызывающей денатурацию белков. Предполагается, что в таком растворителе белковая молекула представляет собой статистический клубок [154]. [c.182]

В отдельных случаях, особенно при иммуноэлектрофорети-ческом анализе низкомолекулярных белков, удобно применять метод внесения антисыворотки, предложенный Бакхаузом в 1967 г. [2]. После нанесения слоя агарового геля на стеклянную пластин- [c.147]

Такая система позволяет получить более четкое разделение. При нанесении образца (в объеме 40 л) элюат, не содержащий аминокислот, сливают в трап. После впитывания всех 40 л отсоединяют первую колонку и оставшиеся три промывают 0,15 н. водным раствором аммиака со скоростью 20 мл/мин, собирая элюат по фракциям объемом 250 мл. Анализ ведут методом бумажной хроматографии. Первую колонку, содержащую основные аминокислоты, соединяют с двумя небольшими колонками (2,5x20 см и 1,7x13,6 см), также заполненными полистиролом. Вытеснение ведут 0,075 н. раствором едкого натрия со скоростью подачи 6 мл/мин (объем фракций равен 250 мл). Профиль элюирования строят по данным хроматографии на бумаге. Объединяют фракции, характеризующиеся наиболее простым составом и максимальным содержанием аминокислот. Эти уже обогащенные смеси вновь фракционируют на сульфокатионите (Zeo-Karb-215) в различных условиях или на дауэксе-2 до получения чистых аминокислот. Не представляющие интереса промежуточные фракции отбрасывают. Условия рехроматографии выбирают с учетом состава смеси. Выход аминокислот составляет около 50% от веса исходного белка. В качестве источника аминокислот используют белковые гидролизаты например, яичного альбумина) или гидролизаты микроорганизмов (например, дрожжей) и даже биологические экстракты [90]. Важно лишь, чтобы смесь не содержала большого количества полисахаридов. [c.356]

Ионит ellex СМ. Колонка 4X22 см после нанесения образца сопутствующие белки отмывали, пропуская 150 мл буферного раствора с pH 6,5. Условия элюирования ступенчатый градиент I40 мМ раствор K I+500 мМ раствор K I в буферном растворе с pH 6,5). Скорость подачи 2,6 мл/мин. Активность ферментов определяли по методу, приведенному [c.26]

Молионная проводимость характерна для р-ров белков и полиэлектролитов, суспензий, эмульсий она широко используется для нанесения полимерных покрытий в электрич. поле (метод электрофореза). Этот вид Э. п. можно наблюдать и в пластифицированных полимерных материалах. [c.470]

Перед нанесением гидролизата пептида или белка на хроматограмму рекомендуется определить в исследуемом образце содержание аминного азота количественным нингидриновым методом Мура [c.15]

В связи с быстрым развитием химии белка и белкового обмена потребовались новые, точные методы определения аминокислот с затратой очень небольших количеств исследуемых объектов и времени. Метод распределительной хроматографии на колонке не всегда удовлетворял этим требованиям. Используемый инертный носитель, чаще всего силикагель, проявлял адсорбционные свойства, что оказывало неблагоприятное влияние на разделение аминокислот, а методика таких работ была очень трудоемкой. В 1943 г. А. Мартин, Р. Синдж, Р. Консден и А. Гордон использовали для анализа малых количеств аминокислот фильтровальную бумагу. В этом случае фильтровальная бумага явилась носителем неподвижной водной фазы. Для разделения смеси веществ они наносили на полосу фильтровальной бумаги маленькую каплю исследуемого раствора, на небольшом расстоянии от края. Затем каплю раствора подсушивали, и этот конец бумаги помещали в растворитель так, чтобы нанесенная капля была несколько выше поверхности растворителя. Растворитель (обычно органический растворитель смешанный с водой) под действием капиллярных сил поднимался вверх по полосе бумаги как только подвижная фаза подходила к месту нанесения смеси веществ, происходило распределение отдельных компонентов смеси мел ду подвижной и неподвижной фазами, основанное на различии их коэффициентов распределения. Все вещества, у которых величина коэффициентов распределения различалась хотя бы незначительно, образовывали отдельные зоны (пятна) на полоске бумаги за счет многократного повторения акта распределения дтежду двумя фазами. [c.79]

В СВЯЗИ с развитием химии белка потребовались новые, быстрые н точные методы определения аминокислот с использованием малых количеств исследуемого вещества. Для этих определений методика распределительной хроматографии на колонке оказалась слишком трудоемкой. На разделении аминокислот неблагоприятно сказывались адсорбционные свойства используемого инертного носителя, чаще всего силикагеля. В 1943 г. Мартин, Консден и Гордон использовали для анализа малых количеств аминокислот фильтровальную бумагу в качестве носителя неподвижной водной фазы, а в качестве подвижной фазы смесь органического растворителя с водой. Для разделения смеси веществ на полоску фильтровальной бумаги наносили маленькую каплю исследуемого раствора и этот конец полоски помещали в растворитель, так чтобы нанесенная капля была несколько выше поверхности растворителя. При этом отдельные компоненты смеси распределяются между подвижной и неподвижной фазами соответственно различию значений их коэффициентов распределения. Даже при незначительных различиях коэффициентов распределения разделяемые вещества образуют отдельные зоны (пятна) на полоске бумаги. [c.53]

Электрофорез на тонких слоях геля крахмала применяли для разделения белков сыворотки [191—193]. Для обнаружения фракций белка слои геля крахмала окрашивали красителем амидным черным 10 В. Обнаружение и идентификацию зон, разделенных электрофоретически, осуществляют методом иммуно-электрофореза. Корнгольд [194] использовал метод, при котором зоны, полученные электрофорезом геля крахмала, диффундировали в слои агара, где они реагировали с нанесенной антисывороткой. Для этого после завершения электрофоретического разделения слой крахмала подрезали лезвием бритвы и осторожно переносили на слой агарового 1,2 %-ного студня. По- [c.516]

Согласно Сполдингу и Меткафу, метод хроматографии на бумаге можно применять для определеиия антиг(>пов. Окрашенный антиген наносят на линию старта и обрабатывают антителом. В том случае, когда происходит реакция, аптиген с антителом остаются на линии старта. Подобный принцип был использован в раз,яичных работах в области капиллярного анализа. Условие успешного проведения анализа заключается в пред-отвраш,епии денатурации белка на линии старта носле нанесения и сушки. Сполдинг и Меткаф рекомендуют для этоГ цели наносить белки в присутствии сахарозы. [c.505]

Были опубликованы также работы [308, 309], в которых описывается прививка различных полимеров на аминогруппы белков при реакциях поликонденсации. Так, при проведении процесса путем видоизменения известного способа поликонденсации на границе раздела фаз, который обычно используют для синтеза полимеров из диаминов и дихлорангидри-дов дикарбоновых кислот, были получены продукты, полиамидные цепи которых связаны с аминогруппами белков. Для этого шерсть обрабатывали водным раствором гексаметилендиамина и затем несмешивающимся с водой раствором дихлорангидрида себациновой кислоты. Образовавшийся линейный полиамид химически связывается с волокнами шерсти, вероятно, в результате взаимодействия концевой хлорангидридной группы с аминогруппой белка. Доказательством того, что в выбранных экспериментальных условиях была осуществлена прививка, является тот факт, что полиамиды, синтезированные по этому методу, не экстрагировались из шерсти обычными растворителями для найлона, в то время как те же полимеры, предварительно полученные и нанесенные на шерстяные волокна из раствора, легко экстрагировались с них, как и можно было предполагать заранее. Блокирование аминогрупп шерсти путем ацетилирования препятствовало прививке на них, и полиамиды, получающиеся в присутствии ацетилированной шерсти, легко удалялись с нее растворителями. [c.421]