Скорость элюции

Рис. 7. Зависимость дисперсии ширины хроматографической зоны (2 ) от скорости элюции (и)

Но за время очевидно, пз колонки выходит вся жидкость, которая исходно находилась между гранулами, т. е. свободный ( мертвый ) объем колонки У . Далее при иеизменной скорости элюции и к моменту д, когда хроматографическая зона достигнет конца колонки, из последней успеет выйти объем жидкости Уд, который можно назвать объелюм элюцииь зоны. Из соотноитения (8) следует, что и объем элюции будет в (1 + А) раз больше, чем свободный объем [c.28]

В проведенном теоретическом рассмотрении было сделано предположение, что исходная зона имеет очень малую (точнее, бесконечно малую) ширину. На самом деле это не так начальная зона имеет форму прямоугольника, который, очевидно, не может скачком превратиться в колоколообразную кривую распределения Гаусса. Вначале расширение зоны идет за счет размывания ее переднего и заднего фронтов (рис. 8). Можно доказать, что профиль каждого фронта может быть описан соответствующей половиной кривой Гаусса. Практически в большинстве случаев аналитического фракционирования хроматографические пики за время прохождения по колонке, расплываясь, успевают принять колоколообразную форму распределения Гаусса, поэтому сделанные выше качественные выводы относительно выбора скорости элюции и диаметра гранул сохраняют свою силу и для реального хроматографического процесса. [c.31]

Решив вопрос о защитной петле, можно освободить зажим на сливной трубке и включить насос для подачи в удлинительную трубку буфера с рабочей скоростью элюции. В таком режиме следует прокачивать буфер до тех пор, пока уровень сорбента не опустится до своего почти окончательного положения в колонке. После этого можно отсоединить насос и дать возможность буферу из удлинительной трубки полностью войти в колонку, а удлинительную трубку (или [c.70]

Запишем некоторые вытекающие из полученного заключения следствия. Время, необходпмое для того, чтобы передний фронт элюента дошел до конца колонки ( о), очевидно, можно подсчитать по скорости элюции п длине колонки =. Ыи. Сопоставляя это с вглражением (5), найдем, что время элюции зоны д в (1 + К) раз больше, чем [c.28]

Каждая отдельная дисперсия вносит свой вклад в суммарную дисперсию, т. е. в расширение хроматографической зоны. Приведенные выражения позволяют понять характер влияния выбора параметров хроматографического процесса на ширину зоны, т. е. содержат в себе очень важную практическую информацию. Наг рпмер, легко видеть, что с увеличением диаметра гранул зона расширяется как за счет неоднородности тока жидкости, так и особенно за счет неравновесности распределения молекул вещества по объемам подвижной и неподвижной фаз. Эта неравновесность будет сказываться тем меньше, чем больше значения коэффициентов диффузии и Оа, т. е. чем легче диффундирует вещество. С другой стороны, облегчение диффузии (увеличение и О ) влечет за собой раси]и-рение зоны за счет продольной диффузии (особенно в подвижной фазе). Скорость элюции и) также влияет двояким образом. С ее увеличением вклад продольной диффузии в расширение зоны умень-шается, зато сильнее сказываются все неравновесности распределения. Наконец, все факторы без исключения увеличивают дисперсию зоны пропорционально длине колонки L. Отсюда следует, что движение хроматографической зоны вдоль колонки в неидеальных условиях связано с непрерывным расширением зоны. Это должно нас насторожить в отношении целесообразности увеличения длины колонки. [c.29]

Очевидно, что должен существовать какой-то оптимум скорости элюции, ири котором обеспечивается минимальное расширение зоны. Действительно, построение графика зависимости = / и) дает всегда кривую с минимумом (рис. 7), которому и отвечает оптимальная скорость элюции. Практически ее не рассчитывают, а подбирают эксперп.ментально по минимально.му расширению хроматографического пика. Но это не делает наше теоретическое рассмотрение излишним. Оно показывает характер зависимости рас]пирепия зоны от скорости элюции. Из рис. 7 легко видеть, что для скоростей,, не превышающих оптимальную, дисперсия очень резко (ио гипер- [c.29]

Следует подчеркнуть, что высота теоретической тарелки характеризует отнюдь не только саму колонку. Из параметров собственно колонки на величину Я явныд образом влияет диаметр гранул (с1), а неявным — коэффициент л, значение которого сильно зависит от степени однородности набивки колонки. Однако, кроме этих параметров, высоту Я определяют и выбор скорости элюции (и), и характер диффузии вещества в обеих фазах ( , , В ), и распределение вещества между зонами (Л), и кинетика сорбции (к). Таким образом, для разных препаратов или при разных условиях элюции одна и та же колонка может характеризоваться различнылш значениями Я. [c.32]

Из формулы (21) следует, что улучшать разрешение эффективнее не за счет длины колонки, а за счет выбора хроматографической системы, обеспечивающей более выраженное различие сродства двух веществ к неподвижной фазе. Следует подчеркнуть, что если хроматографическая система разделения близких зон отработана на малой колонке, то при переносе ее на колонку большего размера следует увеличивать объем только за счет ее диаметра, оставив подобранную длину колонкп неизменной. Скорость элюции (мл/ч) следует повысить ироиорционально увеличению площади сечентш колонки, с тем чтобы линейная скорость течения подвижной фазы (илп, что то же самое, расход элюента в расчете на 1 см площади сечепия колонки) оставалась неизменной. [c.35]

Обессоливание и смена буфера с помощью гель-фильтрации широко используются в ходе очистки белков и пептидов для освобождения от сульфата аммония или в качестве промежуточной операции, подготавливающей препарат к последующему этапу хроматографии (ионообменной, аффинной или других видов). Если объем раствора белка изл еряется миллилитрами, то рутинную операцию его очистки нередко ведут вслепую . Однажды откалибровав небольшую колонку с сефадексом С-25, последующий отбор фракций, содержащих высокомолекулярные компоненты, производят по объему элюата, нередко просто путем отсчета капель. Соотношение объемов исходного раствора и колонки в этом случае может составлять примерно 1 10. В препаративных вариантах обессоливания, когда желательно максимально использовать объем колонки и избежать разбавления препарата, 5то соотношение можио увеличить до 1 3, контролируя выход хроматографических зон по УсГ-поглощению. Скорость элюции в таких опытах может быть значительной, порядка 20мл/см -ч (скорость продвижения фронта зоны очищаемого вещества по колонке — 20 см/ч). [c.137]

В большинстве случаев перед хроматографическим процессом стоит задача надежного разделенпя двух илп более заранее известных компонентов исходной смеси. Еслп хроматографическая система j e определена, то в распоряжении экспериментатора етце остается возможность выбора целого ряда физических параметров процесса с целью оптимизации условий разрешения зон (пиков) в этой снстеме. Краткое знакомство с основами теории хроматографии имело целью дать обоснования для такого выбора. Теперь можно подвести итоги. Последовательно рассмотрим следующий ряд параметров геометрия колонки, размер гранул, набивка колонки, скорость элюции, физические свойства элюента (вязкость, температура) и, наконец, загрузка колонки. Рассмотрение будем вести с позиции улучшенпя разрешения и одновременно уменьшения продолжительности хроматографического процесса. Но сначала надо привести еще одну зависимость — скорости ЭоЛюции и от разности давлений иа входе и выходе колонкп Д/ ( перепад давления ) и от размера гранул. Ее описывает уравнение Дарси [c.36]

Для слишком длинной колонки поддержание оптимальной скорости элюции может потребовать чересчур большого перепада давлений. Действительно, пз (22) следует очевидный вывод, что необходимый перепад давлений (АР иЬц1к(Р) прямо иропорционалеп длине колонки. С этой точкп.чрення необходимо оцепить возможности имеющегося насоса п опасность деформации гранул пспо.1Ь.чуемого сорбента к этим проблемам мы вернемся ниже. [c.37]

В тех случаях, когда (ири достаточно д1алых размерах гранул) скорость элюции за счет повышенного давления удается увеличить, не следует забывать о возможности денатурации макромолекул Б результате их сжатия под высоким давлением. [c.46]

Если элюция колонки осуществляется без насоса ( самотеком ), то при снижении уровня жидкости в колбе будет уменьшаться гидростатический папор, а следовательно, и скорость элюции. Чтобы избежать этого, можно воспользоваться колбой Мариотта (рис. 25, б). Она отличается от обычной лишь тем, что в ее горловину плотно вставлена резиновая пробка, в которой закреплена еще одна (дренажная) трубка, немного не достающая до дна колбы > открытая в атмосферу. При вытекании элюента из колбы Мариотта над его уровнем начнет создаваться разрежение, уровень жидкости в дренажной трубке будет снижаться, а затем через нее в свободный объем над элюентом пузырьками начнет поступать воздух. Этому моменту отвечает равенство суммы давлений слоя элюента и разреженного воздуха над ним атмосферному давлению, которое будет сохраняться до тех пор, пока уровень элюента не опустится до конца дренажной трубки. Таким образом, колба Мариотта ведет себя как открытый сосуд, в котором уровнь жидкости остается неизменным на высоте нижнего конца дренажной трубки. От этой высоты в замкнутой гидравлической системе, куда входит и колонка, следует отсчитывать перепад уровней, создающий гидравлический напор Н (рис. 25, г). Когда система замкнута, колбу Мариотта (так же как открытую колбу) можно опускать пли поднимать, изменяя величину напора Н и Скорость элюции. Можно опускать колбу и ниже верхнего конца колонки. Замкнутая гидравлическая система работает как сифон. В этом случае особенно важно быть уверенным в герметичности посадки пробки в гнездо колонки. На рис. 25, в показан другой популярный вариант колбы Мариотта, в котором используется делительная воронка, установленная непосредственно на колонку. [c.73]

То и другое связано с использованием гранул со средними размерами 10, 5 и даже 3 мкм, что позволяет получить очень хорошее разделение прп большой скорости элюции (см. гл. 1), а высокое давление необходилго для того, чтобы обеспечить такую скорость в условиях повышенного сопротивления мелких, плотно упакованных гранул. [c.92]

Сефакрилы. Структура, а также химические и адсорбционные свойства материала этих матриц (декстран, сшитый метиленбисакри-ламидом) были описаны выше. Главным его достоинством — по сравнению с сефадексом — является жесткость, благодаря чему гель-фильтрацию на сефакрплах, в том числе на крупнопористых, можно вести при относительно больших скоростях элюции. [c.117]

Жесткость сефакрилов, в том числе и наиболее крупнопористых, позволяет использовать их в водных буферах со скоростями элюции порядка 40 мл/см -ч и не слишком сильно снижать пх при работе с вязкими элюептами. Так, сефакрил S-400 не сжимается прп элюции колонки 6 М раствором гуанидинхлорида со скоростью 20 мл/см -ч, а сефакрил S-1000 позволяет с такой же скоростью вести элюцию чистым формамидом. Разумеется, столь высокие скорости [c.118]

Для обессоливанпя и рассортировки молекул скорость элюции может быть выбрана довольно большой — порядка 20 мл/см- ч (следует предварительно проверить сжимаемость геля ). Как было показано в гл. 1, с позиций достижения наилучшего разрешения пиков существует оптидгальная скорость хро.матографического фракционирования. Слишком медленная элюция приводит к резкому уширению пиков за счет продольной диффузии, слишком быстрая — к более ностененному их уширению за счет нарушения равновесия поперечной диффузии. Оптимальная скорость зависит от размеров молекул и гранул, увеличиваясь с уменьшением тех и других. Для ориентировки можно указать, что оптимальная скорость элюции для белков составляет примерно 2 мл/см -ч (для определения объемной скорости элюции это значение надо умножить на илощадь сечения колонки). Однако нередко имеет смысл в интересах оптимизации условий эксперимента в целом значительно отступить от оптимальной скорости элюции в сторону ее увеличения. [c.136]

Представим себе, что хроматографический опыт но гель-фильтрации проведен и мы можем проанализировать его результаты. При этом мон ет оказаться, например, что некоторые пики едва разделены, но разрешение именно того ника, который нас интересует, оказалось избыточным. Напомним, что величина разрешения (/ ,з) представляет собой отношение расстояния между вершинами двух соседних пиков (в миллилитрах элюеита или сантиметрах на ленте самописца — безразлично) к ширине ника у его основания. Разрешение считается приемлемым, если / , == 1. Если В,, оказалось заметно больше единицы, то можно попробовать существенно увеличить скорость элюции, например в 10 раз. Пусть, например, прп скорости элюции 2 мл/см -ч разрешение для пика нужного вещества оказалось равным 2,5. Увеличим скорость элюции до 20 мл/см -ч. Эта цифра — отнюдь не чрезмерная в гл. 1 упоминалось, что увеличение скорости элюции в 5 раз против оптимальной нередко не очень сильно ухудшает разрешение. Между тем, мы тем самым в 10 раз сократим время элюции. Пики, конечно, несколько расширятся, препарат разбавится, но если это допустимо, то выигрыш времени всегда желателен. Предположим теперь, что разрешение все еще больше единицы (наиример, для новой скорости элюции Ед = 1,5). Вспомним (см. гл. 1), что разрешение пропорционально [c.136]

Препаративную очистку полисом из 3—5 мл лизата Е. соИ, обработанного ДНКазой, проводили на колонке сефарозы 4В (2,5 X 33 см F = 165 мл). В элюенте присутствовало 10% глицерина, и скорость элюции была снижена до 4 — 5 мл/см -ч. Иа рис. 74 представлен профиль элюции. В заштрихованной области выходят очищенные полисомы, во фракции 63 — рибосомы, а в промежутке между ними обнаруживаются в различных пропорциях смеси чистых рибосом с комплексами, содержащими 2 — 3 рибосомы [Tai, Davis, 1979]. [c.142]

ОТ 2900 до 76 ООО. С их помощью строили градуировочную кривую (график селективности) для колонки биогеля А-5т (1,5 х 85 см) при скорости элюции 3 мл/см -ч. Объем препарата — 0,15 мл (0,1% Vt). В одно разделение пускали 4-5 белков, по 10 мг каждого. Для определения Vg ж Vt к белкам добавляли голубой декстран до 0,6% и ДНФ-аланин до 0,1% (или С-глпцин). На рис. 78 показана полученная авторами зависимость. В диапазоне 7000—40 ООО Дальтон она оказалась практически линейной. [c.153]

Никаких неприятностей не происходит, если воспользоваться сшитой агарозой. По данным Ансари и Мэйг, колонка с сефарозой L-6B выдерживала воздействие 6 М гуанидинхлорида без видимых изменений своих характеристик в течение 10 мес. Жесткость матрицы позволила им увеличить скорость элюции до 6,8 мл/см -ч. Авторы использовали колонку размером 1,5 х 90 см, а элюцию вели 6 М раствором гуанидинхлорида в 0,1 М Na-фосфатном буфере. pH 7. Для семи белков с молекулярными массами от 2900 до 69 ООО был получен совершенно линейный калибровочный график [Ansari, IVIage, 19771. [c.153]

В том же году Уи провел фракционирование набора из 16 денатурированных белков на колонке TSK-GEL 3000 SW (фирмы Тоуо Soda ) размером 0,75 X 60 см. В качестве элюеита был использован, как обычно, 6 М раствор гуанидинхлорида в 0,01 М фосфатном буфере, pH 6,5. Скорость элюции была снижена до 66 мл/см -ч, и фракционирование длилось 50 мин. Как видно пз рис. 79, точки калибровочного графика хорошо ложатся на прямую [c.155]

Следует еш е раз подчеркнуть, что при этом можно ограничиться весьма умеренными перепадами давления на колонке, допустить заметный уровень его пульсации и вообще отказаться от использования дорогостоящих современных хроматографов для ЖХВД в пользу более простых систем, подобных той, которая была разработана для хроматографии белков фирмой Pharma ia и подробно описана в конце гл. 3. Разумеется, при обессоливании или смене буфера, в котором растворен белок, нет нужды вести элюцию столь же медленно, и в соответствующем примере из той же брошюры фирмы LKB использована скорость более 90 мл/см -ч. Еще большие скорости элюции могут потребоваться при использовании гель-фильтрации под высоким давлением для целей технологического экспресс-контроля, например в пищевой промышленности, но в этом случае от требования высокой разрешающей способности метода придется отказаться и нельзя будет обойтись без использования специальной аппаратуры для ЖХВД. [c.161]

Скорость течения жидкости (скорость элюции) можно регулировать наклоном пластины (обычно в диапазоне 5—20°). Для проявления результатов фракционирования удобнее всего воспользоваться методом снятия реплики. На влажный гель на 1 мин кладут листок толстой фильтровальной бумаги ( Whatman 3 ММ ) и прижимают его стеклянной пластиной. За это время жидкость из пространства между гранулами переходит на бумагу, а вместе с ней — и макромолекулы, находившиеся в подвижной фазе каждой хроматографической зоны. Фильтровальную бумагу затем подсушивают и пятна на ней выявляют одним из многочисленных методов окраски белков или НК, путем регистрации ферментативной активности, радиоактивности, иммунными методами и т. д. Все эти методы выявления были подробно рассмотрены при описании электрофореза и иммуноэлектрофореза [Остерман, 1981, 1983]. [c.163]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология