Гексокиназа определение активности

В качестве сопрягающих ферментов часто используют дегидроге-назы и их коферменты в окисленной или восстановленной форме. Например, активность гексокиназы определяют в системе, содержащей дегидрогеназы глюкозо-6-фосфата и НАДФ. Скорость восстановления НАДФ соответствует скорости гексокиназной реакции. Иногда используют системы двойного или тройного сопряжения, однако конечным звеном такой системы является соответствующая дегидрогеназа (например, при определении активности фосфофруктокиназы, креатин-киназы). При определении активности в сопряженной системе следует учитывать ряд условий. [c.208]

Рис. 7.7. Определение активности гексокиназы в системе, в которой протекает сопряженная фер.ментативная реакция, катализируемая глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, глюкоза, АТР, Mg и NADP добавлены в избытке. В этих условиях скорость общей сопряженной реакции зависит от количества добавленной гексокиназы. Эту скорость определяют по образованию NADPH, который поглощает свет при 340 нм.

Определение активности гексокиназы [c.216]

Определение активности гексокиназы. Активность фермента определяют энзиматическим методом по количеству образовавшегося в ходе реакции Г-6-Ф. Метод основан на использовании сопряженной де-гидрогеназной реакции согласно схеме (с. 41). За ходом реакции следят на спектрофотометре по увеличению оптической плотности при 340 нм в результате восстановления НАДФ+. Показания прибора регистрируют каждые 30 с в течение 3 мин. [c.376]

Препараты фермента были получены путем гомогенизирования свежих или лиофильно высушенных тканей с вероналовым или трис-буфером и последующего центрифугирования при 3000 g. Особенностью этих препаратов являлось высокое содержание в них сахаров и неорганического фосфата, что характерно как для проводящих, так и для паренхимных тканей. Поэтому определение активности гексокиназы по убыли глюкозы в опытной смеси или по убыли суммы легкогидролизуемого фосфата АТФ неорганического фосфата оказалось невозможным. Мы определяли действие гексокиназы непосредственно по количеству образующегося в течение опыта глюкозо-6-фосфата (и фруктозо-6-фосфата). Гексозомонофосфаты были выделены из опытной смеси путем фракционирования по Умб-рейту. Их количественное определение производили с помощью хроматографии на бумаге. Пятна глюкозо-6-фосфата и фруктозо-6-фосфата были элюированы с бумаги, и фосфорные эфиры определены по их сахарному компоненту с антроном [18]. [c.249]

Сложные взаимоотношения между различными железами внутренней секреции, регулирующими углеводный обмен, еще не выяснены. Так, известно, что для нормального баланса расщепления и синтеза углеводов необходимы секреты щитовидной железы (тироксин), поджелудочной железы (инсулин) и коры надпочечников. Недавно Кори и Кори показали, что экстракты коры надпочечников, а также определенные фракции гипофиза, способны оказывать тормозящее действие на активность гексокиназы, энзима мышц, контролирующего обратимое фос-форилирование глюкозы — важный этап в процессе использования глюкозы животным организмом. Это торможение снимается инсулином, хотя сам по себе, в отсутствие тормозящих факторов гипофиза или надпочечников, инсулин не оказывает влияния на активность гексокиназы. Эффект действия передней доли гипофиза не зависит от адренокортикотропного гормона, так как он неактивен. Гормоны коры надпочечников с атомом кислорода при Сц, обладающие гликогенной активностью, не оказывают тормозящего действия аморфная фракция активна. Однако действие экстракта коры надпочечников ке простое оно проявляется на экстрактах из мышц животных, больных диабетом, но отсутствует в опытах с экстрактами мышц нормальных животных, если к ним не добавлена активная фракция экстракта передней доли гипофиза. [c.448]

Одну из общих проблем энзимологии составляет выяснение вопроса, почему специфичность ферментативных реакций часто проявляется в максимальных скоростях, т. е. при высоких концентрациях субстрата, при которых фермент насыщен субстратом. Можно было бы ожидать, что специфичность должна проявляться в связывании субстратов, так что плохой субстрат должен слабо связываться с активным центром, но, связавшись, должен реагировать нормально. Модель замка и ключа способна объяснить, почему с активным центром фермента связываются субстраты лишь определенной структуры, однако она не может объяснить специфичность в отношении констант скоростей каталитической стадии, что является характерным свойством ферментов. Наиболее непонятное положение существует для субстратов небольших размеров, которые в состоянии связываться, хотя и непрочно, с активным центром и должны бы были претерпевать превращение. Так, фермент гексокиназа катализирует перенос фосфатной группы от АТФ на воду так же, как на гидроксильную группу специфического акцептора — глюкозы, но скорость реакции с водой составляет всего лишь З-Ю доли скорости реакции с глюкозой [7]. Совершенно очевидно, что вода в состоянии проникнуть в активный центр фермента, так что малая скорость реакции несомненно связана с низкой реакционной способностью воды в области активного центра. Многие другие ферменты, катализирующие перенос групп, эффективно катализируют перенос на специфические гидроксильные акцепторы, но катализируют слабо или не катализируют вообще перенос на воду. [c.228]

За обычный рабочий день, когда идет очистка фермента, иногда проводят лишь одно или два, но чаще десять или двадцать измерений активности, а во время элюции их может понадобиться еще больше. Многие смеси для тестирования ферментов содержат целый ряд компонентов — буферы, соли, субстраты, кофакторы и т. д. поэтому приготовление отдельно каждой смеси не только неудобно, но и плохо в том отношении, что вследствие небольших изменений и ошибок в процессе приготовления состав смеси каждый раз будет меняться. Лучше всего подсчитать, сколько смеси расходуется за день, и приготовить весь необходимый объем сразу, исключив из него субстрат, который добавляют в последний момент при каждом определении. Некоторые реактивы, наприМер простые буферные и солевые растворы, можно смешивать и хранить (охлажденными) в течение нескольких недель. Таким образом можно приготовить реактив А , включающий все компоненты буфера, соли и, возможно, кофакторы чтобы получить полную смесь, в него нужно добавить лишь один или два компонента. Многие биохимические реактивы весьма устойчивы в незамороженных растворах, при условии что исключено бактериальное или грибковое заражение. Для этого обычно достаточно добавить одну каплю 20%-ного раствора азида натрия на каждые 20 мл раствора. Многие исходные концентрированные растворы можно хранить при этом в течение нескольких месяцев в холодильнике. Другие реактивы могут быть химически неустойчивыми, и поэтому их надо приготавливать каждый день заново. Азид натрия редко влияет на ферменты, и, во всяком случае, он сильно разбавляется, если исходные растворы реактивов были концентрированными. В качестве примера приведем протокол смешивания реактивов для определения гексокиназы. [c.307]

Получают препарат II изозима гексокиназы из растворимой клеточной фракции скелетных мышц крысы. После определения белка микробиуретовым методом оценивают удельную активность фермента, а также степень очистки. При этом учитывают, что на долю II изозима гексокиназы приходится 60% от общего содержания фермента в растворимой клеточной фракции скелетных мышц. [c.376]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология