Градиентная элюция

Легко понять, что при градиентной элюции хроматографические зоны должны сужаться ( обостряться ). Действительно, поскольку сила элюента, поступающего в колонку, все время увеличивается, то такое постепенное и непрерывное увеличение будет иметь место [c.42]

Если же эти компоненты слишком сильно расходятся между собой (а наиболее гидрофобные из них элюируются с трудом), попробовать сорбент типа КР-2 или перейти на градиентную элюцию, когда процентное содержание органического растворителя в элюенте будет возрастать от минимального, при котором хорошо элюируется наименее гидрофобный компонент смеси, до максимального значения, отвечающего оптимальным условиям элюции наиболее гидрофобного компонента. [c.192]

Вместо ступенчатой элюции может оказаться целесообразным постепенно увеличивать концентрацию., например от В1 до А , т. е. перейти на непрерывный (линейный или нелинейный) градиент концентрации соли. Сравнительные достоинства ступенчатой и градиентной элюции рассмотрены в гл. 1. [c.266]

Денситометры, флюориметры и коллекторы фракций были описаны в гл. 3. Так как в случае ионообменной хроматографии объем препарата, особенно при градиентной элюции, может быть значительным, принято сбор и нумерацию фракций начинать с момента внесения препарата на колонку. [c.295]

Используемый в литературе термин градиентная элюция относят лишь к та-> кому виду градиента. [c.106]

В некоторых случаях, в частности, в опытах, имеюш.их целью определение оптимального состава растворителя для метода, который затем будет использоваться повседневно, удобна методика градиентной элюции. Состав смеси растворителей, входящих в подвижную фазу, во время хроматографирования непрерывно меняют с предварительно установленной скоростью, что дает возможность на одной хроматограмме разделить сложную смесь веществ, имеющих совершенно разные коэффициенты распределения. [c.421]

В основе разделения методом адсорбционной хроматографии лежат различия в степени адсорбции веществ адсорбентом и растворимости их в соответствующем растворителе. Эти свойства определяются в основном молекулярной структурой соединения. Колонка для адсорбционной хроматографии представляет собой трубку, заполненную адсорбентом. В нее вносят подлежащую разделению смесь веществ, а затем пропускают через нее растворитель (или смесь растворителей). Разделение основано на том, что вещества с более высоким эффективным коэффициентом распределения продвигаются по колонке с большей скоростью, отделяясь таким образом от веществ с более низким коэффициентом. В большинстве случаев вымывание осуществляется за счет увеличения полярности растворителя (градиентная элюция). Некоторые компоненты образца элюируют в исходном растворителе для удаления более прочно связанных веществ применяют более полярные растворители. Если разделяемые соединения в растворе большей полярности растворяются лучше, эффективный коэффициент распределения повышается. [c.48]

Разделение сахаров и их фосфатов градиентной элюцией на ионообменных колонках [2406]. [c.326]

Рефрактометрический детектор с полой призмой менее чувствителен к изменению состава растворителя и, следовательно, более пригоден для градиентной элюции, чем рефрактометрический детектор френелевского типа. Однако детектор Френеля имеет больший линейный диапазон измерения. [c.94]

II вдоль всей ее длины. Следовательно, и внутри любой хроматографической зоны эффективность э.чюции будет нарастать от переднего ее фронта к заднему. Это означает, что расположенные позади участки зоны должны мигрировать несколько быстрее, чем участки, идущие впереди, — зона сжимается, подтягивает хвост . Кстати, это наводит па мысль, что градиентная элюция должна давать особенно благоприятный эффект в случае нелинейной изотермы распределения и в других случаях, когда задний фронт мигрирующей зоны размывается, образуя хвост . Такое заключение подтверждается практикой. [c.42]

Обострение зоны в ходе градиентной элюции будет продолжаться, до тех пор, пока изменение силы элюента на длине суженной зоны не окажется уже слишком малым, чтобы воспрепятствовать расширению зоны за счет продольной диффузии и неоднородностей течения подвижной фазы. Следует ясно отдавать себе отчет в том, что (в случае линейной изотермы распределения) градиентная элюция пе дает выигрыша в разреилении близко идущих зон. Одновременно с описанным сужением зоны каждого компонента уменьшаются и расстояния [c.42]

I Выбор между ступенчатым и непрерывным законами изменения силы элюеита диктуется в первую очередь степенью различия ио сродству к неиодвпжной фазе между группами кодгаонентов и внутри них. Если различия между группами очень велики, то предпочтение следует отдать ступенчатому градиенту (рис. 13). Конечно, можно задать столь крутой закон постепенного (наиример, линейного) нарастания силы элюента, что эти группы окажутся достаточно сближенными, но разрешение инков внутри групп при этом может пострадать, так как предел сужению зон внутри груииы кладет диффузия вещества и неоднородность, в то время как уменьшение расстояния мен ду зонами с ростом крутизны градиента ничем не ограничено. Однако, прежде чем в каждом конкретном случае сделать выбор между ступенчатой н непрерывной градиентными элю-циями, следует принять во внимание целый ряд чисто практических соображений, которые изложены нин е в форме сжатого перечисления достоинств и недостатков обоих типов градиентной элюции. [c.43]

Рис. 123 иллюстрирует разделение модельной смеси пяти белков (угольной ангидразы, кональбумина, а-лактальбумина, БСА и Р-лактоглобулина) на анионообменнике Mono Q посредством градиентной элюции (0—0,35 М Na l в 0,05 М Трис-НС1, pH 8). Стоит обратить внимание на то, что фракционирование занимает всего лишь 2 мин1 [c.315]

Достоинства ступенчатой элюцпи. 1. Простота и воспроизводимость. 2. Равновесные условия элюцип легче реализуются на каждой ступени, где характеристики элюента остаются неизмениьппь Это приводит к лучшему разрешению пиков, а сила (например, концентрация) элюента нередко может быть ниже, чем при непрерывной градиентной элюции. [c.43]

Недостатки ненрерывиой градиентной элюции- 1- Р1меется опасность плохого разрешения (пли даже неразделення) зон двух близких по своим хроматографическим свойствам компонентов, если [c.43]

Это означает, в частности, что фракционирование макромолекул путем изократической элюции в большинстве случаев имеет мало шансов на успех. Подавляющее большинство макромолекул ири данном выборе элюента либо уже будет находиться в подвижной фазе, либо окажется слишком прочно связанным с неподвижной фазой. Непрерывная линейная градиентная элюция здесь удобнее, так как она для одиого белка за другим создает ситуацию, отвечающую быстрой десорбции. Отметим нонутно, что можно исходно уменьшить среднее число точек сорбции и тем самым улучшить условия разрешения, если уже при внесении вещества на колонку уравновесить ее жидкой средой, которая препятствует многоиози-циопной сорбции вещества в колонке, напрпмер солевым раствором умеренной концентрации. Одиако подобрать такую концентрацию, которая была бы оитимальпои для всех компонентов смеси макромолекул, удастся редко. [c.46]

Сопоставляя цепрерынпую и ступенчатую градиентные элюции макромолеку.т, иоилю заключить, что первая из них, как правило. [c.46]

В открытую колонку (без адаптора) препарат вносят вручную из пипетки. Начинают с того, что спускают жидкость из колонки так, чтобы открылся (но не начал обсыхать ) слой сорбента. Затем сливную трубку зажимают. Раствор препарата остороншо, чтобы не взмутить сорбент, заливают по стенке колонки, начиная от расстояния в 1 мм над поверхностью сорбента и постепенно вместе с уровнем раствора препарата продвигая кончик пипетки вверх по стенке. После того как весь объем препарата внесен в колонку, сливную трубку освобождают от зажима и дают слою препарата войти в сорбент до того момента, когда его поверхность снова обнажится. Так же, как описано, вносят объем элюента, равный объему препарата, а затем спускают его в сорбент. Такую промывку стенок колонки целесообразно повторить еш е раз. После этого заливают (так же) некий объем элюента (на высоту 1—2 см) и вставляют верхнюю пробку с капельницей. Слой свободного элюента предназначен для того, чтобы обеспечить образование некоторого разрежения над сорбентом, необходимого для всасывания жидкости из резервуара, если он располагается ниже верха колонки при элюции без насоса (образование сифона), или для предотвраш ения обнажения верхнего слоя сорбента при. неработающем насосе и открытом сливе из колонки (в первый момент после открывания слива пз колонки вытекает немного жидкости, затем, если система герметична, вытекание прекращается). Вместе с тем следует иметь в виду, что в слое свободного элюента над сорбентом происходит перемешивание градиента, поэтому в случае градиентной элюции высота этого слоя должна быть минимально необходимой. После того как внесение препарата п подготовка колонки закончены, можно присоединить резервуар нли насос, открыть сливную трубку п начать элюцию. [c.77]

Важную роль в устройстве детектора играет рациональная конструкция кювет, исключающая возможность образования областей застаивания жидкости. Применяются как цилиндрические, так и прямоугольные кварцевые кюветы объемом в несколько десятков микролитров с длиной оптического пути от 2 до 10 мм. В конструкции УФ-детектора 11У-2 применена система одновременного прохождения света по двум путям (рис. 36) вдоль длины прямоугольной кюветы (20 мм) и в поперечном направлении (1 мм). Если такой прибор укомплектовать двухканальным регистратором (напрпмер, КЕС-482)> фирмы Р11агшас1а)>), то можно при одном и том же усилении сигнала с фотоэлементов вести регистрацию одновременно на двух значениях чувствительности, отличающихся друг от друга в 20 раз.. Это позволяет заметить пик малого поглощения и одновременно прописать форму интенсивных пиков от сильно поглощающих компонентов смеси веществ. Многие фирмы строят свои УФ-де-текторы по двухлучевой схеме прибор оснащается дополнительной кюветой сравнения, через которую может протекать чистый элюент, а луч света от лампы с помощью полупрозрачного зеркала расщепляется и проходит параллельно через две кюветы — рабочую и кювету сравнения. Двухлучевая схема позволяет исключить из регистрации собственное поглощение элюента, которое может изменяться в ходе градиентной элюции, а также кОдМпенсирует изменения яркости лампы, упрощая решение проблемы ее стабилизации. [c.83]

В начале 1982 г. было опубликовано исследование, посвященное сопоставлению возможностей использования RP-8-, RP-18- и феппл-силикагелей для фракционирования трипсиновых пептидов в двух вариантах линейной градиентной элюции обычного градиента концентрации пропанола при pH 4 и ион-парной хроматографии с градиентом концентрации ацетопитрила. Были выбраны следующие комбинации растворителей при элюции пропанолом раствор А — 0,25 М пиридин в 0,9 М СН3СООН (pH 4) раствор В — 60%-ный раствор пропанола в растворе А. При ион-парной хроматографии использовали следующие комбинации раствор А — 0,09 %-ный водный раствор ТФУ раствор В — смесь ТФУ, воды и ацетопитрила в пропорции 0,09 9,91 90. В обоих случаях использовали линейный градиент (О—70%) раствора В в смеси с раствором А. [c.206]

Элюцию ступенчатым или непрерывным градиентом осуществляют чаще всего за счет изменения концентрации соли в буфере неизменного состава. Изменение pH буфера используют, как правило, для ступенчатого градиента с целью нейтрализации, а иногда и изменения знака заряда компонентов фракционируемой смеси или нейтрализации самого обменника. Условия посадки препарата на колонку при градиентной элюции обычно бывают таковы, что он концентрируется в верхней части колонки (начальные значения коэффициентов распределения велики). В силу этого объем препарата роли не играет и может быть значительным. Загрузка не должна превышать 5—10% от фактической емкости колонки для данного вещества. Исходя из этого можно рассчитать необходимое количество набухшего сорбента. В случае ступенчатого градиента загрузка может быть вьпле, приближаясь к 100% при переходе к статическому варианту хроматографии. [c.289]

Начнем с вопроса о длине колонки. В гл. 1 было показано, что в случае изократической элюции разрешение пиков улучшается с увеличением длины колонки. Для градиентной элюции это не совсем так. Хроматографические зоны продвигаются по колонке намного медленнее, чем течет элюент. В случае градиентной элюции в какой-то момент времени ушедшую вперед зону может догнать концентрация соли, отвечающая практически полной десорбции мигрирующего в ней вещества. С этого момента такая зона будет двигаться вместе с элюентом. Когда это произойдете последней, исходно наиболее прочно сорбированной зоной, все зоны, еще остающиеся в колонке, будут продвигаться с одинаковой скоростью, не расходясь, а даже сближаясь друг с другом за счет продольной диффузии веществ. Поэтому градиентную элюцию чаще всего ведут па срав- [c.293]

Теперь рассмотрим варианты систем элюцпи, обеспечивающих такое разрешение для всего комплекта аминокислот. Ввиду явного различия хроматографических характеристик трех групп аминокислот и сходства этих характеристик внутри каждой группы можно ожидать, что наилучшпм вариантом окажется трехступенчатая градиентная элюция (изократическая на каждой ступени). [c.517]

При ионообменной хроматографии смесь белков сорбируется в верхней части колонки и затем вытесняется веществами, уменьшающими их сорбцию на ионите. Понижение сорбции осуществляют повышением ионной силы раствора и (или) изменением его pH. Изменение pH и ионной силы элюирующего буферного раствора можно проводить путем создания ступенчатой или градиентной элюции (с. 104). [c.109]

Гидролизат РНК (с. 176) или фракцию рибонуклеотидов, полученную в результате гель-фильтрации (с. 176), разбавляют так, чтобы концентрация солей в нем была менее 0,02 М, доводят pH до 7,8 и осторожно наносят на колонку. Устанавливают скорость тока жидкости 0,2—0,5 мл/мин на 1 см поверхности геля. Колонку трижды промывают 2 мл 0,02 М забуференного раствора Na l, не содержащего мочевину. Затем вносят 5 мл стартового буфера и присоединяют колонку к системе для градиентной элюции (см. с. 104). В сосуд 2 наливают 250 мл стартового буфера, в сосуд 1 — 250 мл 0,3 М Na l. Собирают фракции по 5 мл и определяют в них оптическую плотность при 260 нм. Строят профиль элюции. [c.177]

Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе рН-градиентная элюция. На колонку размером 1,2X27 см, заполненную ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную фосфатным буфером (реактив Л Ь 2), наносят раствор белка. Элюцию проводят в градиенте pH, используя 150 мл буфера (реактив № 2) в смешивающем сосуде, и 150 мл буфера (реактив № 4) во втором сосуде. На колонку можно нанести примерно 10 мг белка. Скорость элюции — 20 мл/ч. Собирают фракции по 4 мл. В процессе хроматографии pH изменяется от 7,0 до 5,0. Первым (после выхода из колонки примерно 100 мл раствора) выходит изозим I и вслед за ним — белок, соответствующий изозиму П. [c.219]

Дальнейшее разграничение касается трех альтернативных методов, которые могут быть применены для всех типов колонок. Наиболее широко применяется элюционный анализ. Он сводится к тому, что смесь веществ, растворенных в минимальном объеме растворителя, наносят на колонку и последовательно вытесняют каждую зону путем элюирования растворителями с повышающейся полярностью (петролейный эфир, бензол, диэтиловый эфир, ацетон, этиловый спирт, уксусная кислота). Поскольку в этих условиях для большинства веществ характерны нелинейные изотермы адсорбции, то наблюдается образование хвостов , которое часто затрудняет разделение на отдельные четкие зоны. Это затруднение можно с успехом обойти, прибегнув к градиентной элюции , которая состоит в постепенном непрерывном изменении состава элюирующего раствора. [c.20]

В зависимости от сорбционных свойств разделяемых компонентов и их соотношений в разделяемой смеси применяются разные методы тонкослойной хроматографии [5] а) хроматография с элюентом постоянного состава б) хроматография с элюентом переменного состава при фронтальном разделении многокомпонентного элюента на активном слое (полизональная хроматография) в) градиентная элюция г) хроматография в условиях поперечного размывания пятен д) двумерные комбинированные методы тонкослойной хроматографии. [c.86]

Первые три метода различаются по степени однородности состава элюента вдоль хроматографической пластинки, которая задается как изменение состава элюента, поступающего на пластинку (градиентная элюция), так и фронтальным разделением многокомпонентного элюента на активном слое пористого материала (полизональная хроматография). Как тот, так и другой методы целесообразно использовать для разделения компонентов, относящихся к разным классам органических соединений с резко различающимися сорбционными характеристиками. [c.86]

Фотометрические детекторы для жидкостной хроматографии являются, как правило, двухдучевыми. С их помощью определяют разность поглощения света в измерительной и сравнительной кюветах, через которые, соответственно, пропускают элюат с колонки и растворитель. Может быть использован и принцип двухволновой фотометрии, когда детектор имеет только одну кювету, через которую движется элюат с колонки. Фотометрирование проводят на двух длинах волн. При этом на одной длине водны поглощает как хроматографируемое вещество, так и растворитель, а на другой — только хроматографируемое вещество. Таким образом, можно выделить поглощение света анализируемым веществом. Однако для этого необходимо знать соотношение мольных акстинкций растворителя на обеих длинах волн. Преимуществом метода двухволновой фотометрии является возможность более точного учета изменения оптической плотности растворителя при градиентной элюции и фотометрии оптически неоднородных объектов, например при сканировании хроматографических капиллярных колонок или сканировании пластинок в количественной тонкослойной хроматографии, где необходимо определить оптическую плотность фона и поглощения хроматографического вещества в одной точке пространства. [c.95]

Поскольку в гель-нроника-ющей хроматографии к мало, Ф этого хроматографического метода меньше, чем при адсорбционной хроматографии. Пиковую емкость можно существенно повысить, если использовать градиентную, элюцию, так как при этом ширина всех пиков одинакова и, следовательно, с увеличением к существенно растет число теоретических тарелок N. [c.156]

Для проведения тонкослойной хроматографии методом градиентной элюции в комплекте КТХ-01 предусмотрены автоматическое устройство для создания градиента (автоград) с капиллярными резервуарами для хранения градиентных растворов 4 и проточная камера 5. [c.20]

Сахара Боратные буферные растворы 0,1 0,5Л1, pH = 8—10 (градиентная элюция) 2-Дезоксирибоза—сахароза — трега-лоза—раффиноза—целлобиоза—мальтоза — лактоза—рамноза—(лактоза)— ликсоза — рибоза—манноза— фукоза— арабиноза — фруктоза — галактоза —> ксилоза—сорбоза — глюкоза — гентио-биоза—мелибиоза [c.152]

Нуклеотиды КН2РО4 0,01—Ш, pH — 3,3—4,3 (градиентная элюция) или Na l 0,01—0,2Af, pH = 2—3 (градиентная элюция) НАД — ЦМФ — УМФ — АМФ -ИМФ—ГМФ—УДФ-глюкоза—ЦД Ф — УДФ, АДФ-рибоза—НАДФ+ — АДФ — (ЦТФ) — ГДФ — УДФ-глюкуроновая кислота — ЦТФ — УТФ — АТФ —ГТФ (изомеры нуклеотидов выходят в последовательности 5 —2 —3 ) [c.152]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология