Тяжелый меромиозин

ООО, 37 ООО, 25 000, 21 ООО и некоторые другие. Большинство этих полос соответствует различным фрагментам тяжелых цепей. Следует обратить внимание на то, что, несмотря на наличие разрывов в полипептидных цепях, активность тяжелого меромиозина как АТФазы в полной мере сохраняется. АТФазную активность определяют так же, как и для миозина (с. 393). [c.392]

Переваривание миозина и получение раствора тяжелого меромиозина. Тяжелый меромиозин получают перевариванием миозина трипсином при комнатной температуре. К раствору миозина добавляют имидазольный буфер, приготовленный на 0,5 М КС (pH 7,6), до конечной концентрации имидазола 10 мМ и белка 30—40 мг/мл (можно меньше). Раствор трипсина в 0,5 М K I добавляют к раствору миозина, соблюдая весовое соотношение трипсин — миозин 1 100. Через 30—40 мин протеолиз останавливают добавлением раствора ингибитора трипсина из соевых бобов в двукратном избытке по сравнению с весовым количеством трипсина 3. Трипсиновый гидролизат диализуют в течение ночи [c.394]

Да). Молекула миозина сильно вытянута в длину, причем ее длинная, стержневая часть образована двумя тяжелыми полипептид-ными цепями, которые на этом участке имеют структуру а-спирали и к тому же закручены одна вокруг другой в суперспираль. N-концы тяжелых цепей образуют глобулярные головки , каждая из которых находится в комплексе с двумя легкими цепями. АТФазная активность миозина сосредоточена в головках , имеющих каждая по одному активному центру. В результате ограниченного протеолиза можно получить два типа протеолитических фрагментов, обладающих в полной мере АТФазной активностью так называемый тяжелый меромиозин с м. м. 350 ООО Да, лишенный большей части стержня, или хвоста , миозино-вой молекулы, а также препараты головок . Электрофоретическая картина зависит от вида примененной протеазы, ее концентрации и времени обработки белка. Головки , или, как их называют, субфрагмент-1, полученный путем химиотрипсинового протеолиза, при ДСН-элект-рофорезе дают полосу 96 ООО Да — фрагмент тяжелой цепи, и две полосы легких цепей — примерно 18 000 и 15 000 Да. Две другие легкие цепи отсутствуют вследствие деградации. Тяжелый меромиозин обычно дает целый набор полос, среди которых присутствуют 81 ООО Да, 74 ООО, [c.392]

Кратковременная обработка трипсином расщепляет молекулу миозина на два фрагмента. Из хвостового участка (С-концевой участок молекулы) образуется легкий меромиозин (ЛММ) - фрагмент длиной 90 нм, а из остальной части, включающей головки ,- тяжелый меромиозин (ТММ). ЛММ, подобно миозину, образует нити, однако он не обладает АТФазной активностью и не связывает актин. ТММ катализирует гидролиз АТФ и связывает актин. ТММ можно расщепить далее путем более длительной обработки трипсином или папаином, в результате чего получается один З -фрагмент длиной 40 нм с мол. массой 62000 и два 8 -фрагмента с мол. массой 110000, представляющие собой головки миозина. [c.649]

Получение препарата тяжелого меромиозина [c.394]

Метод получения тяжелого меромиозина (ТММ) основан на частичном протеолитическом расщеплении миозина под действием трипсина. Отделение тяжелого меромиозина от миозина и от фрагмента хвостовой части миозиновой молекулы (легкого меромиозина) основано на его хорошей растворимости при низкой ионной силе, когда легкий меромиозин и миозин выпадают в осадок. Для последующей очистки полученного препарата можно воспользоваться колоночной хроматографией или высаливанием сернокислым аммонием. [c.394]

Сложную картину с большим числом полос наблюдают при электрофорезе препарата тяжелого меромиозина в присутствии додецилсульфата натрия. В этом случае представляет интерес сопоставить данные по электрофорезу препарата ТММ (тяжелого меромиозина) в диссоциирующих и в недиссоциирующих условиях. Нативный электрофорез в этом случае проводят в трис-глициновом буфере (pH 8,9) на пластинах с 5%-ным разделяющим гелем и 2,5—3%-ным концентрирующим гелем. В этом случае препарат тяжелого меромиозина дает в основном одну полосу, расположенную недалеко от старта, с м. м. 350 ООО Да. Это свидетельствует о том, что, несмотря на наличие многочисленных внутренних разрывов в полипептидных цепях, возникших в результате протеолиза, фрагменты цепей держатся вместе за счет нековалентного взаимодействия. При этом обеспечивается функциональная целостность структуры (сохранение АТФазной активности). [c.397]

Легкий меромиозин (первая фракция) Тяжелый меромиозин [c.131]

КРГ — кортикотропин-рилизинг-гормон ТММ — тяжелый меромиозин [c.385]

Рис. 56.5. Ферментативное расщепление миозина. ТММ —тяжелый меромиозин ЛММ -легкий меромиозин 8-

Очистка препарата тяжелого меромиозина осаждением сернокислым аммонием. Наиболее простым способом очистки служит высаливание фермента сернокислым аммонием. При этом собирают фракцию, выпадающую между 40—60% насыщения Следует, однако, соблюдать два условия во-первых, использовать сернокислый аммоний, перекристаллизованный с ЭДТА, так как даже следовые количества ионов магния, прочно связываясь с ТММ, ингибируют активность, и, во-вторых, перед добавлением к раствору фермента раствора насыщенного сернокислого аммония необходимо проконтролировать pH последнего и в случае необходимости довести его до нейтрального или слабощелочного. Выпавший в осадок тяжелый меромиозин отделяют центрифугированием, растворяют в небольшом объеме (3—6 мл) бидистиллята и диализуют при О—4 °С в течение ночи против 1 л бидистиллированной воды, чтобы освободиться от сернокислого аммония. Внешний раствор несколько раз меняют и проводят контроль на присутствие в нем ионов 5042- с помощью насыщенного раствора хлористого бария. В диализном мешочке может вновь выпасть осадок, который следует отцентрифугировать и отбросить. В надосадочной жидкости одним из общепринятых методов определяют содержание белка, которое обычно составляет 1—10 мг/мл. [c.395]

Поперечные мостики могут замыкаться не на любом участке актиновой нити, а на ее дискретных центрах (глобулах). Это обнаруживается в экспериментах, в которых изолированные актиновые нити обрабатывались тяжелым меромиозином — фрагментом молекулы миозина, отщепляющимся под действием трипсина и содержащим головку и часть стержня. При такой обработке образуется комплекс, в котором частицы тяжелого меромиозина располагаются регулярно по спиралям активной нити и имеют стереотипную ориентацию. [c.218]

Очистка препарата тяжелого меромиозина с помощью ионообменной хроматографии. Для очистки фермента можно также воспользоваться методом колоночной хроматографии. Для этого супернатант после осаждения миозина и легкого меромиозина (15—30 мл) наносят на колонку (2x11 см) с ДЭАЭ-целлюлозой (ДЭАЭ-52, ватман), уравновешенную 50 мМ трис-НС1 буфером pH 7,9. После нанесения белка колонку промывают двумя объемами того же буфера. Белок элюируют линейным градиентом КС1 от О до 0,5 М (2x250 мл). [c.395]

Оказалось, что глобулярная N-концевая часть молекулы миозина [тяжелый меромиозин — ТММ и субфрагмент 1 (81) миозина] хорошо растворимы при низкой ионной силе и со- [c.179]

Тяжелый меромиозин (ТММ) обладает совершенно иными свойствами. ТММ катализирует гидролиз АТР и связывает актин. [c.264]

Тяжелый меромиозин элюируется с колонки одним пиком. Фракции этого пика диализуют в течение 1 ч против раствора с 5 мМ ЭДТА, затем в течение ночи против бидистиллированной воды (2—3 смены). Следует помнить, что все операции по выделению и очистке проводятся на холоде. Раствор фермента в бидистиллированной воде хранят в холодильнике и используют в течение 2—3 нед. [c.395]

Влияние модификации сульфгидрильных групп под действием ПХМБ на АТФазную активность миозина (или тяжелого меромиозина) [c.398]

При расщеплении М. кратковременным действием трипсина образуются два фрагмента, к-рые наз. легким и тяжелым. меромиозинами (обозначаются соотв, LMM и НММ). LMM представляет собой фрагмент стержневой части молекулы М. длиной ок. 80 нм и с мол.м. 150 тыс. НММ содержит головку М. и часть хвоста, его длина 60-70 им, мол. м. ок. 340 тыс. При действии папаином или при длит, воздействии трипсина от молекулы М. отщепляются головки (т. наз. субфрагменты 1, или SJ с мол. м. 120 тыс. Стержневой фрагмент НММ, к-рый отщепляется при денствин папаина, наз. субфрагментом 2 (Sj). [c.92]

Рис. 11.5. Влияние Mg + на поведение тяжелого меромиозин а 3-1 (1) и тринпт-рофенилированного тяжелого меромиозина 5-1 (2) на колонках с АТР—агарозой, АДР—агарозой и АМР—Р (МН) Р—агарозой [873].

Однако их присутствие не изменяет и даже слегка понижает (особенно Са2+) сродство к ADP- и АМР-Р (NH)P—агарозе. Двухвалентные катионы одновременно ускоряют расщепление связанной молекулы АТР как нативным, так и трннитрофенилнрованным тяжелым меромиозином S-1, что было показано главным образом для агарозы с присоединенными молекулами [у- Р] АТР. [c.375]

Мономеры актина могут соединяться друг с другом, образуя димеры и тримеры, но только тримеры достаточно стабильны, чтобы служить затравками для дальнейшей полимеризации. Сразу после образования затравки (вероятно, тримера) начинается рост полимера — элонгация. Этот процесс может идти на обоих концах фила-мента, но скорость его для одного и другого конца, как правило, Неодинакова. Путем декорирования филаментов тяжелым меромиозином (образующим на филамен-тах структуры, похожие на наконечники стрел) может быть определена их полярность. На оперенном конце филамента (к которому обращены тупые концы стрел после декорирования миозином) элонгация идет быстро, а критическая концентрация полимеризации актина для этого конца ниже, чем для другого (в присутствии АТР). Заостренный конец (к которому обращены наконечники стрел) растет медленнее и характеризуется более высокой критической концентрацией. Полимеризация сопровождается гидролизом АТР, однако гидролиз не необходим для полимеризации, поскольку она так же хорошо идет и в присутствии негидролизуемых аналогов АТР [5]. По мере удлинения филаменты могут фрагмен- [c.10]

Взаимодействие между миозином и актином, на котором основано превращение химической энергии в механическую энергию в мышце, изучено Боттомлн и Трейером [138]. Исследовалось влияние ионной силы на специфическое и обратимое связывание тяжелого меромиозина и миозинового субфрагмента 1 на сефарозе с иммобилизованным G-актином. Комплексы, образуемые между производными миозина и иммобилизованным G-актином, могут диссоциировать при низких концентрациях АТР и ADP и пирофосфатов как в ирисутствии, так и в отсутствие Mg +. Кроме того, и связанный с сефарозой, и свободный G-актин лишь немного увеличивают Мд-+-стимулируемую АТРазную активность миозина. Такой подход позволяет решить вопрос, обязательно ли комилек-сообразование между миозином и актином приводит к активации АТРазы. [c.376]

По данным Сент-Дьердьи, под действием протеолитических ферментов (трипсина) миозин расщепляется на два компонента Н-меромиозин (тяжелый меромиозин), с которым связана аденозинтрифосфатазная активность миозина, и L-меромиозин (легкий меромиозин), лишенный этой активности. [c.417]

Тяжелый меромиозин (ТММ) представляет собой растворимый белок с мол. массой 340000, содержащий и фибриллярный, и глобулярный фрагменты (рис. 56.5). Он обладает АТРазной активностью и связывается с Р-актином. При гидролизе ТММ па- [c.335]

Рнс. 56.5. Ферментативное расщепление миозина. ТММ—тяжелый меромиозин ЛММ—легкий мерюмиозин 8- [c.336]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология