САР-цАМФ

Особую роль в организме играет циклический аденозин-3, 5 -монофосфат (цАМФ, 303), который образуется ферментативно внутри клетки из АТФ после воздействия соответствующего гормона на клеточные рецепторы (см разд. 2 5 1). Например, повышение содержания гормона адреналина (первичного сигнала) в крови приводит к синтезу внутриклеточного цАМФ (вторичного сигнала, регулятора и усилителя гормонального сигнала), который вызывает ингибирование синтеза запасного топлива - гликогена и готовит клетку к выработке энергии Так, скелетные мышцы, печень и другие ткаии в условиях стресса мобилизуются адреналином и цАМФ к массированной переработке энергетических резервов для синтеза высокоэнергетических молекул АТФ. Полагают, что алкалоиды чая и кофе (см разд. 5.4.9) связывают фермент, который гидролизует цАМФ после передачи сигнапа. Это обстоятельство приводит к увеличению концентрации цАМФ в клетке и активированию ею фосфорилазы, стимулирующей сердечную деятельность и глико-генолиз в печени, т.е. к появлению тонизирующего эффекта [c.167]

Было показано, что ЦАМФ, помимо высвобождения глюкозы, участвует, по-видимому, в качестве второго посредника, более чем в сорока клеточных процессах. Она, в частности, повышает сокращаемость сердечной мышцы, увеличивает выделение соляной кислоты железами слизистой оболочки желудка, снижает агглютинацию тромбоцитов крови, усиливает или снижает образование ряда ферментов. Дальнейшее изучение циклической АМФ, а возможно и других вторых посредников, позволит получить значительно более полную информацию о том, каким образом клетки организма взаимодействуют между собой. [c.422]

Моноклональные антитела к растворимому белковому антигену IgG к регуляторной субъединице цАМФ-зависимой протеинкиназы). [c.325]

Очистка антигена. Цитозольную фракцию из мозга свиньи (с. 379) пропускают через колонку с иммуносорбентом (1x2 см) в фосфатном буфере (pH 7,4) и колонку промывают тем же буфером. Элюцию проводят 2 М глициновым буфером (pH 2,8), фракции нейтрализуют 2 М трис-НС1 буфером, pH 8,6 Определяют концентрацию белка, цАМФ-связывающую активность (с. 331) она не должна быть ниже 12 нмоль/мг. Проверяют чистоту полученного препарата регуляторной субъединицы (м. м.=56 ООО Да) методом электрофореза (с. 119). Таким же способом, имея моноклональные или поликлональные антитела к соответствующим антигенам, можно получить гомогенные препараты этих антигенов. [c.325]

ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ цАМФ-ЗАВИСИМЫХ ПРОТЕИНКИНАЗ [c.330]

Получение цАМФ-зависимой протеинкиназы из скелетных мышц [c.330]

Определение цАМФ-связывающей активности [c.331]

Фосфофруктокиназа — один из ключевых ферментов, регулирующих процесс гликолиза в целом. Активной формой фермента является тетрамер, состоящий из 4 субъединиц с молекулярной массой 83 000 Да каждая. В зависимости от условий тетрамеры могут превращаться в высокополимерные агрегаты или диссоциировать на неактивные димеры и мономеры. Фосфофруктокиназа является аллостерическим ферментом. К числу аллостерических эффекторов относятся субстраты (АТФ, фруктозо-6-фосфат) и продукты реакции (АДФ, фруктозо-1,6-дифосфат), а также такие метаболиты, как АМФ, цАМФ, цитрат, фруктозо-2,6-дифосфат, фосфокреатин, 3-фосфоглицерат, 2-фосфо-глицерат, фосфоенолпируват, ионы МН4+, К+, неорганический фосфат и др. [c.238]

Перед определением активности готовится среда инкубации и делается необходимое разведение протеинкиназы. К рассчитанному объему буфера Г добавляют нерадиоактивный цАМФ до концентрации 1 мкМ радиоактивный цАМФ добавляется в таком количестве, чтобы в 10 мкл смеси был счет радиоактивности около 30 000 имп/мин (10 мкл из среды инкубации наносят на фильтр, сушат и просчитывают в сцинтилляторе ЖС-106). Разведение фермента проводят в отдельных пробах так, чтобы в 20 мкл раствора содержалось по 10, 20, 30, 40, 50 мкг белка соответственно. Среду инкубации раскапывают по 95 мкл в инкубационные пробирки. К пробам добавляют по 20 мкл соответствующего раствора протеинкиназы (в контрольную пробу добавляют 20 мкл буфера). Пробы инкубируют в холодильнике (или во льду) в течение 1,5—2 ч. [c.331]

Перед определением активности готовят среду инкубации и делают соответствующие разведения фермента. К рассчитанному объему буфера Е добавляют АТФ до конечной концентрации 50 мкМ, гистон Н1 — до концентрации 3 мг/мл, цАМФ — до концентрации 10 мкМ, радиоактивный АТФ — в таком количестве, чтобы счет радиоактивности в 10 мкл среды составлял около 40 000 имп/мин (10 мкл среды наносят на фильтр, высушивают и просчитывают в сцинтилляторе ЖС-106 в фосфорном канале). Фермент разводят таким образом, чтобы в 20 мкл раствора было по 2, 3, 5, 7, 10 мкг белка соответственно. Фильтры нумеруют, надписывая их простым карандашом. [c.332]

Трис-НС1 — 500 мМ раствор, pH 7,5, содержащий 1 мМ цАМФ. [c.368]

В условиях мягкого кислотного гидролиза цАМФ не разрушается, тогда как АТФ теряет фосфатную часть молекулы, и вся радиоактивность [а— Р] АТФ, не включенная в цАМФ, переводится в неорганический фосфат. Это позволяет отделить цАМФ от фосфата путем избирательной сорбции фосфата на окиси алюминия. [c.369]

Тканевой ( второй ) передатчик возбуждения. Катехоламины и серотонин вызывают повышение активности аденилатциклазы, приводящее к увеличению концентрации цАМФ внутри клеток. [c.227]

Фермент, катализирующий процесс образования циклив ческого аденозин-3, 5 -моиофосфата (цАМФ). [c.228]

Значительный вклад в выяснение механизма действия гормонов внес американский биохимик Эрл Уилбур Сазерленд (1915—1973) своими работами по изучению циклической аденозинмонофосфорной кислоты (ЦАМФ). В процессе исследования действия гормона адреналина на клетки печени и мышц он обнаружил новое химическое вещество, действующее в качестве посредника между гормоном и клеткой, передающее инструкцию от гормона к соответствующему ферментативному механизму клетки. Он назвал это вещество вторым посредником и идентифицировал как ЦАМФ следующего строения [c.421]

Молекула киназы фосфорилазы состоит из субъединиц четырех типов ар б. Молекулярная масса фермента — 1,3-10 Да — отвечает формуле (аРуб)4- Киназа фосфорилазы играет, как показано, ключевую роль в регуляции обмена гликогена и в сопряжении гликогенолиза и мышечного сокращения. В скелетной мускулатуре она существует в двух молекулярных формах нефосфорилированной ( неактивированная ) и фосфорилированной ( активированная ). Первая активна лищь при pH 8,2, вторая — при pH 6,8 и 8,2. При активации фермента отнощение активностей, измеренных при pH 6,8/8,2, возрастает от 0,05 до 0,9—1,0. Активация киназы достигается фосфорилированием а- и р-субъединиц, которое катализирует цАМФ-зависимая протеинкиназа. Каталитическую роль выполняет -субъединица б-субъединица идентична a +- вязывaющeмy белку — кальмодулину. Ферментативная активность киназы фосфорилазы полностью зависит от ионов На р-субъединице фермента имеется регуляторный центр, обладающий высоким сродством к АДФ. Константа Михаэлиса для АТФ равна [c.223]

Регуляторная субъединица цАМФ-зависимой протеинкиназы из мозга (НП). [c.326]

Теоретическая направленность занятий в данном разделе практикума по биохимии связана с анализом основных высокоэффективных механизмов регуляции активности ферментов, обсуждаемых в настоящее время в учебной литературе и на страницах известных биохимических журналов. К таким механизмам относятся аллостерический механизм контроля активности, реализующийся на уровне существования множественных форм ферментов механизм усиления, связанный с функционированием субстратных циклов адсорбционный механизм контроля, реализующийся при обратимом взаимодействии ферментов с биологическими мембранами регуляторный механизм с участием вторичных мессенжеров (цАМФ, С +) и универсальных модуляторов белковой природы (кальмодулин). [c.329]

В качестве донора фосфата используется АТФ, акцептором служат сериновые и треониновые аминокислотные остатки белков. Регуляторная субъединица выступает в данном случае в качестве ингибитора каталитической субъединицы. К обладает способностью связывать цАМФ как в составе холофермента, так и в свободном состоянии. [c.330]

Целью работы является получение в частично очищенном состоянии нативного холофермента цАМФ-зависимой протеинкиназы, определение его цАМФ-связывающей активности, изучение способности диссоциировать под действием цАМФ и определение фосфотрансферазной активности свободной С. [c.330]

Аденилатциклаза (КФ 4.6.1.1) эукариот является ферментом плазматических мембран. Она катализирует реакцию образования цАМФ из АТФ. Фермент состоит из трех компонентов рецептора к гормону, ГТФ-связывающего белка (Ы-белка) и каталитической су единицы. Гормональная активация аденилатциклазы осуществляется в результате следующих взаимодействий компонентов. Гормон, связываясь с рецептором, индуцирует образование тройного комплекса гормон — рецептор — Ы-белок. Связывание ГТФ с К-белком вызывает диссоциацию тройного комплекса с образованием активированного N-бeлкa. Активированный N-бeлoк, содержащий ГТФ, взаимодействует с каталитической субъединицей фермента, увеличивая ее активность. Гидролиз ГТФ до ГДФ и неорганического фосфата ГТФазой Ы-белка приводит к диссоциации комплекса Ы-белка с каталитической субъединицей и выключению фермента [c.368]

Определение активности аденилатциклазы. Реакцию начинают внесением в среду R (объема 25 мкл) препарата аденилатциклазы, содержащего 40—80 мкг белка, и измеряют количество цАМФ в объеме. 50 мкл, образующегося при 30 °С. Реакцию останавливают добавлением 200 мкл 0,5 и. НС1. Пробирки кипятят на водяной бане в течение [c.369]

Содержимое пробирок (450 мкл) наносят на стеклянные колонки размером 1X6 см, заполненные 1 г сухой окиси алюминия. цАМФ элюируют пятью миллилитрами воды в сцинтилляционные флаконы. Счет радиоактивности проводят по Черенкову на жидкостно-сцинтилляцион-ном счетчике в тритиевом канале. [c.369]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология