Выделение белка из вирусных препаратов

На ранних этапах изучения инфекционной РНК ВТМ важно было установить отсутствие в ней вирусного белка с большей точностью, чем это позволяет чувствительность описанных методов. При использовании стандартных методов выделения нуклеиновых кислот содержание белка в выделенном препарате редко бывает ниже 1 %, а в случае ВТМ это соответствует комплексу одной молекулы РНК ВТМ с одной субъединицей оболочечного белка. Однако если выделять РНК в присутствии бентонита, то загрязнение препарата белком значительно снижается. А в случае ВТМ содержание примеси можно снизить еш,е больше (до 1 белковой субъединицы на 20—50 молекул РНК), если использовать метод реконструкции вируса (см. ниже). Определение следовых количеств примесей всегда сопряжено с трудностями методического характера, а достоверность результатов, полученных с помощью различных тестов на минимальных концентрациях веществ, сомнительна. Для определения примеси белка в препаратах вирусных нуклеиновых кислот были поставлены опыты с радиоактивной меткой ( 8) белка. Все, что удалось извлечь из этих опытов, сводится к тому, что содержание остаточного белка, судя по количеству метки, соответствует 0,04% (при пересчете на содержание серы в белковой оболочке ВТМ). Действительно, то соотношение аминокислот, которые в следовых количествах были обнаружены в препаратах нуклеиновых кислот, не соответствует количественным соотношениям этих же аминокислот в белковой оболочке. Тот факт, что препараты, содержащие 0,04 и 1% белка, не различаются по своей инфекционности (на 1 мг РНК), убедительно доказывает, что инфекционность — свойство, присущее вирусной РНК [142, 455]. Положение это убедительно было доказано только для РНК ВТМ. Однако нет никаких оснований сомневаться в том, что вывод этот носит общий характер и что инфекционность всех вирусов заключена в их нуклеиновых кислотах. [c.179]

Выделение белка из вирусных препаратов [c.73]

Полученный вирус уже достаточно очищен (примерно 50 мю белка на 10 ° вирусных частиц), и его можно использовать i различных целях, в частности для выделения вирусной ДНК Из фракции вирус легко осадить обычным центрифугированием Для получения вирусных препаратов высокой степени чистоть может быть использован ряд других методов, включая повтор ное центрифугирование в градиенте сахарозы или s l. Эт1 [c.280]

Обычно для иммунологических исследований (например, ELISA) или иммунизации животных мы выделяем MV из культуральной среды, как описано выше для ВПГ. Однако для анализа спектров вирусных белков и т. д. специалисты рекомендуют использовать метод доктора В. Гибсона, который приводится ниже. Исходным материалом для получения вирусных препаратов максимальной инфекционности и наибольшей чистоты должна быть культуральная среда. Для сохранения высокой инфекционности препарата и целостности вирусных частиц следует избегать осаждения вируса. Впервые центрифугирование в отрицательном градиенте вязкости и положительном градиенте плотности, предложенное Барзилаи и др. [29] для выделения MV, было применено Тэлботом и Алмейдиа [30]. Метод надежен и гарантирует высокую эффективность. Его осуществляют следующим образом [c.291]

Выделение вирусных белков так же, как и очистка вирусов, представляет отдельную проблему. Относительно легко удается выделение белков из тех вирусов, которые содержат только белок и нуклеиновую кислоту. Причем предпочтительнее иметь дело с теми вирусами, оболочка которых построена из идентичных белковых субъединиц. Гораздо труднее выделять гомогенные препараты вирусных белков из сложноорганизоваппых вирусов, Так, в обо-лочке бактериофагов доказано существование нескольких белков, различных по своим свойствам. Еще сложнее рабо тать с вирусами животных и человека, а особенно с миксовирусами. Перспектива достичь выделения всех составных субъединиц оболочки в виде препаратов, пригодных к исследованию, еще более ограничена. К сказанному следует добавить, что возникает еще проблема фракционирования вирусных белков, [c.168]

Результаты многочисленных исследований свидетельствуют о том что генетический код, установленный для Е. соИ, является универсальным. Так, например, в лабораториях Уитмана и Френкель-Конрата препарат РНК, экстрагированный из вируса табачной мозаики, обработали азотистой кислотой известно, что при этом происходит дезаминирование многих остатков цитозина с образованием урациловых остатков, в результате чего кодоны U U (серин) превращаются в UUU (фенилаланин). Аналогичным путем из кодона ССС (пролин) может образоваться СиС (лейцин). Оказалось, что при заражении растений табака препаратом РНК, обработанной азотистой кислотой, аминокислотная последовательность вирусного белка оболочки, выделенного из мутантных штаммов, действительно меняется [22]. Причем многие из происшедших изменений можно было точно предсказать исходя из данных, приведенных в табл. 15-3. Сходным образом, замены аминокислот в дефектных молекулах гемоглобина (рис. 4-17) в большинстве случаев могут быть обусловлены изменением только одного основания. Так, гемоглобин S может образовываться в результате одного из следующих изменений в седьмом кодоне GAA(Glu) GUA(Val) или GAG(Glu)- ->GUG(Val). Еще один аргумент в пользу универсальности генетического кода состоит в способности рибосом и молекул тРНК из Е.соН осуществлять трансляцию цепи мРНК, кодирующей синтез гемоглобина, и синтезировать при этом полноценный гемоглобин [23]. [c.195]

Наследственная информация кодируется последовательностью нуклеотидов в молекуле ДНК. Любая экспериментальная методика, предназначенная для определения последовательности нуклеотидов, требует химически чистых препаратов ДНК. Слово чистый в данном случае означает не только отсутствие примесей других типов молекул, например РНК и белков, но и гомогенность нуклеотидных последовательностей. Все молекулы ДНК в таком образце должны быть одинаковы как по размерам, так и в отношении последовательности нуклеотидов. По этой причине первыми для изучения генетической организации на уровне нуклеотидов были выбраны вирусы прокариотических и эукариотических организмов. Геномы вирусов относительно малы, и вирусные частицы можно довольно легко отделить от клеточного материала еще до химического выделения интактных молекул ДНК из вирусных частиц. Описанное в гл. 7 гетероду-плексное картирование фага X основано на умении генетиков выделять интактные молекулы ДНК из различных линий фага X, геномы которых с генетической точки зрения уже изучены. То же самое относится и к исследованиям, показавшим концевую избыточность нуклеотидных последовательностей фагов Т2 и Т4 и циклические перестановки в их геномах. [c.260]

Одной из задач изучения молекулярной организации вирусов является исследование свойств белковых субструктур, т. е. элементарных молекул белков, из которых построена оболочка вируса. Выделение белковых субъединиц вируса проводят в условиях, при которых не изменяется первичная структура полипеитидной цепи. При этом необходимо получать гомогенные препараты, пригодные для аналитических исследований. В то же время вполне допустимы незначительные или обратимые изменения вторичной и третичной структуры (разрыв некоторых связей). Это, вероятно, основное условие, иа которое необходимо обратить внимание при выделении вирусного белка. Изменения, вследствие которых наступает денатурация, приводят белок в нерастворимое состояние, и дальнейшая работа с такими белковыми препаратами становится невозможной. [c.168]

Выделение РНК из очищен пых или частично очищонптлх препаратов вируса включает освобождение РНК от защитной белковой оболочки и последующее отделение этой пуклеииовой кислоты от белка и любых других вирусных компонентов, например липидов, а также от любых примесей, имеющихся в препарате вируса. В большинстве ранних работ, связанных с исследованием вирусной РНК, ие учитывали лабильность молекул РНК, так что обычно выделяли силыю деградированные продукты. Однако, с тех [c.53]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология