Нуклеиновые кислоты метод выделения

Методы выделения нуклеиновых кислот. При изучении химического состава и строения нуклеиновых кислот перед исследователем всегда стоит задача выделения их из биологических объектов. В главе 2 было указано, что нуклеиновые кислоты являются составной частью сложных белков — нуклеопротеинов, содержащихся во всех клетках животных, бактерий, вирусов, растений. Нуклеиновые кислоты обладают сильно выраженными кислыми свойствами (обусловлены остатками ортофосфорной кислоты в их составе) и при физиологических значениях pH несут отрицательный заряд. Этим объясняется одно из важных свойств нуклеиновых кислот—способность к взаимодействию по типу ионной связи с основными белками (гистонами), ионами металлов (преимущественно с М "), а также с полиаминами (спермин, спермидин) и путресцином. Поэтому для вьщеления нуклеиновых кислот из комплексов с белками необходимо прежде всего разрушить эти сильные и многочисленные электростатические связи между положительно заряженными молекулами белков и отрицательно заряженными молекулами нуклеиновых кислот. Для этого измельченный путем [c.96]

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ [c.439]

Распределительную хроматографию на бумаге используют в качестве быстрого стандартного метода анализа нуклеиновых кислот. Ионообменная хроматография на колонках (см. стр. 446) нашла применение прежде всего для препаративного выделения мононуклеотидов и высокомолекулярных продуктов гидролиза дезоксирибонуклеиновых кислот. Опыты по фракционированию на крахмале [26, 31] или на адсорбенте [55, 56] не привлекли достаточного внимания. [c.442]

Второй раздел практикума ставит своей целью познакомить студентов с особенностями выделения, фракционирования, идентификации и количественного определения различных природных азотсодержащих < оединений. белков, пептидов, аминокислот, нуклеиновых кислот, нуклеотидов и пр Предлагаемые экспериментальные работы включают аиболее широко используемые в лабораторной практике современные методы разделения и анализа этих соединений различные виды электрофореза, хроматографии, спектрофотометрии, колориметрии и др. Работа проводится как на готовых коммерческих препаратах высоко- и низкомолекулярных азотсодержащих соединений, так и на препаратах, выделяемых студентами из различных тканей лабораторных животных. [c.79]

В последние 15 лет были разработаны различные хроматографические методы, позволяющие фракционировать высокомолекулярные нуклеиновые кислоты для этой же цели применяют электрофорез. Хроматографией на бумаге и другими распределительными методами, а также ионообменной хроматографией удалось выделить продукты гидролиза нуклеиновых кислот. Определяя концентрации выделенных оснований, нуклеозидов, моно- и олигонуклеотидов, в настоящее время проводят количественный анализ с очень небольшим количеством гидролизата. [c.437]

Количественное определение нуклеиновых кислот. Принцип метода основан на выделении рибонуклеиновых (РНК) и дезоксирибонуклеиновых (ДНК) кислот и на дальнейшем их анализе прямыми и косвенными методами. К прямым методам относятся такие, которые включают гидролиз нуклеиновых кислот с последующим выделением из гидролизатов пуринов и пиримидинов и определение их хроматографическим методом. Хроматография позволяет производить точный микроанализ нуклеиновых кислот. Исследование пуринов и пиримидинов проводят в ультрафиолетовом свете, наблюдая флуоресценцию пятен на хроматограммах или в экстрактах, полученных из соответствующих участков хроматограмм. Кроме хроматографического метода, применяют также способ электрофореза на бумаге. [c.60]

Среди лабораторных методов очистки, фракционирования и анализа структуры белков, нуклеиновых кислот и их компонентов совокупность различных хроматографических методов занимает центральное место. Ни один другой метод не может сравниться с хроматографией по широте количественного диапазона. Начиная от препаративных колонок объемом в несколько литров, на которых можно вести фракционирование граммовых количеств препарата на первых этапах выделения фермента, через разделение близких по своей природе компонентов очищенной смеси веществ, количество которых измеряется миллиграммами или долями миллиграмма, этот диапазон простирается до микроанализа аминокислотного состава белка, когда на колонку вносят сотые доли микрограмма исходного гидролизата. Вне конкуренции остается и разнообразие физико-химических параметров, по которым может осуществляться хроматографическое фракционирование молекулярные размеры, вторичная или третичная структура биополимеров, растворимость, адсорбционные характеристики молекул, степень их гидрофоб-ности, электрический заряд и, наконец, биологическое сродство к другим молекулам. [c.3]

Помимо ряда вирусных нуклеиновых кислот, большинство выделенных полирибонуклеотидов, бесспорно, представляют собой сложные смеси, содержащие полимеры с различной длиной цепи, нуклеотидной последовательностью и составом оснований (присутствие или отсутствие минорных оснований). Существует ряд приемов для частичного фракционирования, однако, пока не разработаны удовлетворительные методы характеристики, трудно определить степень чистоты или гомогенности рибонуклеиновых кислот. В основу оценки чистоты транспортных РНК, этих сравнительно низкомолекулярных полирибонуклеотидов, может быть положена их ферментативная реакция с аминокислотами (через аминоациладенилаты), что, конечно, позволяет оценить и их биохимическую однородность. [c.365]

Современное развитие химических и биологических наук истребовало более глубокого проникновения в существо изучаемых процессов, детального анализа химического состава разнообразных смесей и биологических объектов. Кроме того, для химического и биотехнологического ироизводства, в том числе для промышленности лекарственных средств, характерны постоянное возрастание требований к чистоте выпускаемых продуктов, ужесточение методов контроля, тенденция к использованию количественных критериев ири оценке качества. Поэтому помимо оценки интегральных характеристик, присущих объекту исследования в целом, часто требуется детальное изучение содержания отдельных компонентов, определяющих состояние биологических систем либо качество химических продуктов. Рещение этих задач, как правило, невозможно без применения достаточно эффективных методов разделения сложных смесей. Среди таких методов доминирует хроматография. Бурно развиваясь в последние десятилетия, этот метод открыл возможности разделения смесей, содержащих десятки и сотни компонентов, их качественного и количественного анализа, препаративного выделения индивидуальных веществ. Принципы хроматографии весьма универсальны, благодаря чему она оказалась пригодной для изучения объектов самой различной природы — от нефти и газов атмосферы до белков, нуклеиновых кислот и даже вирусов. Этим объясняется огромный интерес представителей различных научных и технических дисциплин к хроматографическим методам. Только в пяти специализированных международных журналах по хроматографии ежегодно выходит в свет свыше 2000 публикаций ио различным вопросам теории и применения метода, общее же их число в несколько раз больше. [c.5]

Шведский ученый Пер-Оке Альбертсон предложил использовать для разделения бактерий, вирусов, фрагментов клеток, мембран, ядер, белков, нуклеиновых кислот и любых других частиц биологического происхождения двухфазные водные растворы полимеров — иолиэтиленгликоля, декстрана и их производных [2, 279, 280]. Фракционирование в двухфазной водной системе основывается на избирательном распределении частиц между этими фазами, аналогичном распределению растворимых веществ. Метод Альбертсона получил широкое распространение и используется во многих биохимических и микробиологических лабораториях, так как позволяет в мягких условиях, без нарушения структурной целостности и изменения нативных свойств осуществлять выделение и очистку лабильных биологических объектов, а также дать определенную информацию о их строении. Реализация этого метода в промышленном масштабе, например, для выделения вирусов или получения чистых ферментов, не встречает, по мнению автора, принципиальных трудностей, однако в очистке воды он не может быть использован. Очевидно, и любая другая модификация экстракции жидкость — жидкость неприменима при микробной очистке промышленных сточных вод и, конечно, такой метод совершенно непригоден для водоподготовки. [c.194]

Многократное повторение актов адсорбции и десорбции при течении раствора через слой адсорбента приводит к отставанию наиболее поверхностно-активных компонентов, что позволяет определить их содержание в исходном растворе или отделить их от других, менее адсорбционно-активных веществ. Методы адсорбционной хроматографии широко применяются для фракционирования аминокислот, нуклеиновых кислот, белков и других биополимеров, для выделения различных ферментов и лекарственных препаратов (пенициллина, тетрациклина, алкалоидов и др.). [c.93]

Таким образом, эта глава будет начинаться с широкого рассмотрения методов выделения и разделения смесей нуклеозидов (в основном из природных источников). Общие методы синтеза нуклеозидов будут рассмотрены достаточно подробно, вслед за чем будут описаны синтезы некоторых специфичных типов нуклеозидов, например, С-нуклеозидов, циклонуклеозидов и т. д. Будут лишь перечислены физические методы, используемые для определения структуры нуклеозидов, хотя основные литературные ссылки будут приведены. Будут рассмотрены лишь те химические реакции, которые представляют особый интерес для химика, работающего в области нуклеиновых кислот. Помимо того, общие реакции углеводного остатка и гетероциклов можно найти в главах, относящихся к этим вопросам. [c.70]

В виде неразделимых суспензий, таких, как вирусы, высокомолекулярные белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и т. п. Для выделения такого типа веществ из растворов метод ультрацентрифугирования имеет огромное значение, так как оно протекает при мягких условиях и низкой температуре. [c.193]

К этому времени история изучения нуклеиновых кислот насчитывала уже около восьмидесяти лет. Честь их открытия принадлежит выдающемуся швейцарскому биохимику Фридриху Мишеру, который в 1868—1872 гг. выделил из ядер клеток гноя и спермы лосося новое фосфорсодержащее вещество, названное им нуклеином (от греч. nu leus—ядро). Впервые нуклеиновую кислоту, свободную от белков, получил Р. Альтман в 1889 г., который и ввел этот термин в биохимию. Разработка методов выделения и изучение химического состава нуклеиновых кислот были продолжены в лабораториях А. Косселя, У. Джонса, П. Левина, О. Гам-мерстена, Дж. Гулланда и др. [c.5]

Настоящая книга, издаваемая в серии научных трудов ВИР, освещает методы и методики по определению содержания нуклеиновых кислот в растительных тканях и препаратах. В ней также изложены — идентификация и количественный учет свободных нуклеотидов выделение нативных РНК и ДНК из растений фракционирование их на колонках определение нуклеотидного состава РНК и ДНК методами колоночной и бумажной хроматографии изучение свойств макромолекул нуклеиновых кислот, обнаружение их в клетке, цитофотометрия, определение состояния ДНК и РНК в клетке. [c.2]

Во-вторых, работа с биохимическими объектами, которая касается не только методов выделения и очистки, но и многочисленных исследовательских работ с ними, особенно с белками и нуклеиновыми кислотами, заключается в необходимости манипулировать с очень маленькими количествами вещества — миллиграммами, микрограммами и даже значительно меньшими. При выделении это связано с незначительным содержанием многих компонентов в исходной биомассе, а также в ряде случаев с ограниченным количеством биомассы, например при исследовании редко встречающегося животного или растения или очень мелких живых объектов, которые иногда добываются поштучно и доступны в небольшом числе. [c.231]

Бактериологический метод. Выделение чистой культуры микоплазм является наиболее точным способом подтверждения диагноза. Микоплазмы относят к прихотливым бактериям. Для их культивирования используют питательные среды с добавлением лошадиной сыворотки (источник холестерина) и дрожжевого экстракта (источник компонентов для синтеза нуклеиновых кислот). [c.251]

Зная строение и функцию генов, а также владея методами их выделения и переноса в различные клетки или молекулы нуклеиновых кислот, можно с достаточной уверенностью подходить к постановке генноинженерных работ [c.177]

Методы электрофоретического разделения в полиакриламидном и агарозополиакриламидном гелях широко используются в настоящее время для фракционирования нуклеиновых кислот. Преимуществом этих методов является их простота и возможность контролировать ве-нДичину пор геля. При наличии маркёров с известной молекулярной массой или коэффициентом седиментации очи могут быть использованы для характеристики относительной молекулярной массы выделенных препаратов нуклеиновых кислот. [c.173]

Определение содержания фосфора и азота всегда имело большое значение для анализа нуклеиновых кислот. Для идентификации и количественного определения пурина и пиримидина в продуктах гидролиза нуклеиновых кислот использовали полупрепаративные методы выделения, различные цветные реакции, а также полярографию и микробиологические методы. В настоящее время эти методы анализа, за редким исключением, представляют только исторический интерес. [c.437]

Химия и биохимия полисахаридов — это области, в которых хроматографические методы разделения упоминаются почти в каждом сообщении и высокие темпы развития этих областей связаны главным образом с применением хроматографии. Однако главное назначение хроматографии состоит в выделении полисахаридов из естественных продуктов, в которых они смешаны с различными соединениями, такими, как белки, нуклеиновые кислоты или же вещества более низкой молекулярной массы. Последние соединения очень отличаются по характеру от полисахаридов, и их разделение, следовательно, здесь не рассматривается. [c.129]

Методы, собранные в этих двух книгах, весьма разнообразны и охватывают почти все стороны исследований этой важнейшей грунны соединений. Здесь можно найти методы выделения и анализа отдельных компонентов нуклеиновых кислот (пуриновых и пиримидиновых оснований, нуклеозидов и нуклеотидов), методы выделения, разделения и анализа олигонуклеотидов, изолирования отдельных клеточных органелл, выделения и фракционирования нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), а также изолирования их суммарной фракции для различного рода исследований, способы идентификации нуклеиновых кислот, методу. модификации их молекул, методы изучения их синтеза как in vivo, так и in vitro, методы изучения нуклеиновых кислот в связи с процессом биосинтеза белка и, наконец, методы изучения биологических свойств нуклеи1говых кислот, в том числе их иммунологических свойств. [c.5]

Успехи в химии нуклеиновых кислот, совершенствование препаративных методов их выделения и очистки позволили более глубоко исследовать превращения, происходящие при радиолизе. [c.216]

Дополнительные рекомендации н методам выделения и фракционирования нуклеиновых кислот [c.69]

Прямые физические методы. Самым старым и самым прямым методом исследования биополимеров следует считать, по-видимому, электронномикроскопический метод. Недавно Клейншмидт обнару кил, что если препарат нуклеиновой кислоты, непосредственно выделенный из живого организма методом осмотического шока или взятый после предварительного выделения, комплексировать с каким-нибудь основным белком, например с цитохромом с, то его mohiho нанести на поверхность воды в виде моно-молекулярной пленки. На фиг. 51 приведена электронная микрофотография фаговой ДНК, полученная Томасом и Мак-Хатти при помощи этого метода. Снимок позволяет оценить размеры молекулы ДНК и ясно показывает, что эта молекула замкнута в кольцо. Определенная таким способом длина молекулы, равно как и ее диаметр, соответствуют величинам, которых следует ожидать на основе гипотезы Уотсона — Крика. Показано, что молекулы ДНК из многих источников имеют форму кольца или замкнутой петли. У ДНК фагов Я и Т2 переход от линейной формы к кольцевой осуществляется легко и обратимо. [c.143]

Очевидно, что многие нуклеозиды являются интермедиатами в биосинтезе н расщеплении нуклеотидов и полинуклеотидов. В дополнение к так называемым спонгонуклеозидам (термин, применяемый к модифицированным пуриновым нуклеозидам, полученным из карибской губки ryptotethya rypta), которые являются производными арабинозы, многие антибиотики являются производными нуклеозидов, часто имеющих модифицированные углеводные остатки они будут детально обсуждаться позднее. Нуклеозиды сравнительно легко выделить из химических или ферментативных гидролизатов природных полинуклеотидов условия и практические детали этого процесса можно найти в общих учебниках по нуклеиновым кислотам [2, 7, 24]. Все коммерчески доступные образцы основных нуклеозидов получены этим путем. Для выделения больщих количеств таких нуклеозидов наиболее целесообразно применение относительно грубого фракционирования, основанного на различной растворимости, и методов ионного обмена. Для выделения малых количеств модифицированных нуклеозидов либо из природного источника, либо полученных в результате химического синтеза, пригодны многочисленные более эффективные методы, и они будут обсуждаться отдельно. Наконец, следует помнить, что выделение нуклеозидов часто осуществляют дефосфорилированием нуклеотидов [25], выделение и разделение которых не будет рассматриваться в настоящей главе. [c.72]

Использование гель-фильтрации для освобождения от радиоактивных предшественников неоднократно цитировалось при описании методов введения радиоактивной метки в белки и нуклеиновые кислоты [Остерман, 1983]. Нередко обессоливание используют и на заключительном этапе очистки для освобождения не только от соли, но и от прочих низкомолекулярных примесей. Например, в одной из работ по выделению РНК-полимеразы очисткой белка на биогеле А-1,5т завершалась целая серия операций, включавшая различные варианты переосаждений белка и ионообмениой хроматографии [Vaisius, Horgen, 1979]. [c.138]

Данный метод является одной из модификаций метода Шмидта и Таннгаузера. Разделение РНК и ДНК в результате щелочного гидролиза осуществляется после предварительного выделения нуклеиновых кислот из биологического материала. [c.166]

Быстрые методы определения последовательности не решают всех задач, стоящих перед исследователем первичной структуры нуклеиновых кислот, поскольку они не дают информации о Положении и природе минорных компонентов нуклеиновых кислот- Такие задачи встречаются при изучении структуры тРНК. В этих случаях сохраняют свое значение старые методы определения последовательности, заключающиеся в исчерпывающем нли частичном гидролизе рибонуклеазами, выделении индивидуальных олигонуклеотидов, определении их клеотидного состава и идентификации минорных компонентов [c.329]

Нуклеозиды могут быть получены прямым гидролизом нуклеияовы.х кислот, минуя стадию выделения мононуклеотидов и именно этим методом они обычно получаются в препаративных целях. Для этого нуклеиновые кислоты подвергаются химическому или ферментативному гидролизу. Обычно их нагревают с концентрированным аммиаком 3—3,5 часа при 175—180°. Ферментативный гидролиз НК вызывают специальные ферменты, называемые нуклеазами. Ввиду неустойчивости дезоксирибозы и дезоксирибозидов при препаративном гидролчзе ДНК, с целью получения нуклеозидов успеха можно достигнуть только при ферментативном гидролизе. [c.190]

Выделение и идентификацию компонентов нуклеиновых кислот производят с помощью физико-химических методов. Очень важную роль в разделении сложных смесей играют хроматографические методы ( см. 15.1). Пиримидииовые и пуриновые основания, обладающие заметным поглощением около 260 нм, обычно идентифицируют с помощью УФ-спектроскопии (см. 15.3.1). Поскольку нуклеотиды имеют кислотный характер и способны находиться в ионизированном сосюя НИИ, то для идентификации их используют также электрофорез (см. 15.1). [c.444]

Типичным представителем антагонистов метаболитов, участвующих в синтезе нуклеиновых кислот, является азасерин (85) , который первоначально был выделен из фильтрата культуры 81гер1отусез, а позднее получен синтетическим методом. Это соединение препятствует протеканию биохимических процессов с участием глутамина (86). [c.424]

Нуклеиновые кислоты сравнительно легко можно выделить из нуклеопротеида, например экстракцией клеток нейтральными ])аствора.ми хлористого натрия. Однако, возможно, что нуклеиновые кислоты при таком способе выделения несколько деградируют. Более жесткие методы, например экстракция щелочными раствора.ми, вызывают значительную деградацию. Выделение нативного 1уклеопротеида в форме, удобной для физикохимического исследования, явилось весьма трудной задачей, но теперь она, по-видимому, решена. Доти и Заби [97] выделили нуклеопротеид из зобной железы в молекулярно дисперсной форме и определили его молекулярный вес методом светорассеяния. По их данным, он составляет 19 106. Молекула нуклео-аротеида состоит, видимо, из одной молекулы нуклеиновой кис- [c.246]

Молекулярный вес этих соединений очень велик. Вирус табачной мозаики, выделенный в кристаллическом состоянии [166], представляет собой нуклеопротеид с молекулярным весом порядка 40 млн. Палочконодобная молекула вируса имеет ядро из нуклеиновой кислоты, окруженное белковой оболочкой, которая может быть отделена. Первоначально с помощью физических методов определили, что молекулярный вес этого белка равен 100 ООО. Однако молекулярный вес, вычисленный на основании аминокислотного анализа, равен 17 ООО—18 ООО. В литературе имеется обзор, посвященный работам по структурному составу этого вируса [58]. [c.417]

Макромолекулы, такие, как белки, полисахариды и нуклеиновые кислоты, внутри своих индивидуальных групп отличаются по физико-химическим свойствам лишь незначительно поэтому их выделение, основанное на различиях в этих свойствах, например, с помошью ионообменной хроматографии, гель-фильтрации или электрофореза сопряжено с известными трудностями и требует много времени. Вследствие этого в ходе выделения существенно падает их активность из-за денатурации, расщепления, ферментативного гидролиза и т. п. Одним из наиболее характерных свойств этих биологических макромолекул является их способность обратимо связывать другие вещества. Например, ферменты образуют комплексы с субстратами или ингибиторами, антитела— с антигенами (против которых получены), а нуклеиновые кислоты, такие, как информационная РНК, гибридизуются с комплементарными ДНК и т. д. Образование специфических диссоциирующих комплексов биологических макромолекул служит основой метода их очистки, известного как аффинная хроматография. [c.9]

По своей сути аффинная хроматография — идеальный метод для изучения взаимодействий в биохимических процессах. Иммобилизованная лейцил-тРНК-синтетаза использована как для выделения изолейцил-тРНК, так и для изучения взаимодействия белка с нуклеиновой кислотой [10]. Взаимодействия пептидов с белками [12] и нуклеотидов с аминокислотами и пептидами [20] [c.17]

Области применения аффинной хроматографии расширяются, поокольку метод основан на специфических взаимодействиях биологически активных веществ. Как видно из табл. 11.1, этот метод успешно используется при выделении самых разных соединений. Наряду с этим он полезен при изучении различных систем на аффинных сорбентах можно разделять низкомолекулярные энан-тиомеры и удалять нежелательные вещества из живых организмов. -Например, аффинной хроматографией можно разделить на оптические антиподы 0,Ь-триптофан. Используя специфическое выделение меченых пептидов, можно определить пептиды активного центра фермента, связывающего участка антител или участка пептидных цепей на поверхности молекулы. Аффинная хроматография может быть использована для изучения возможности замены природных пептидных цепей ферментов различными модифицированными синтетическими пептидами. Активные центры ферментов или антител, связывающие свойства субъединиц, специфичность ферментов по отношению к различным ингибиторам, комплементарность нуклеиновых кислот, взаимодействие нуклеотидов с пептидами, влияние присутствия различных соединений на образование специфических комплексов и т. д. могут быть исследованы с помощью аффинной хроматографии. [c.282]