Агароза степень активации

Иммобилизация ЛДГ на активированной бромцианом агарозе позволяет достаточно легко получать различные формы ЛДГ, в частности мономер. В зависимости от условий эксперимента и степени активации носителя в образовании ковалентных связей между белком и агарозой может участвовать различное число субъединиц фермента. Необходимым условием получения мономерной формы является наличие препарата ЛДГ, иммобилизованного через одну субъединицу. [c.386]

Подготовка носителя к работе. В качестве матрицы, на которой иммобилизуют фермент, в работе используют активированную бромцианом агарозу, имеющую 12—14 активированных групп/мл. При использовании препарата-носителя с данной степенью активации получают препарат ЛДГ, иммобилизованный по четырем субъединицам. Для иммобилизации через одну субъединицу исходный препарат агарозы подвергают следующей обработке, ведущей к снижению степени ее активации. [c.387]

Степень активации агарозы, оцениваемая данными о емкости по связыванию небольших пептидов [1], прямо пропорциональна pH. Активация проводится при pH 11. Методика активации сефарозы бромцианом детально описана ниже [2, 12, 55]. [c.189]

Иммобилизация ГАФД. В качестве матрицы, на которой иммобилизуют фермент, в работе используют активированную бромцианом агарозу, имеющую 12—14 активированных групп/мл. Для получения препаратов ГАФД, иммобилизованных через одну или две субъединицы, данная степень активации носителя должна быть понижена. Соответствующая обработка агарозы описана на с. 387. [c.384]

Для активации больших количеств агарозы и для активации мембран из агарозы или тонких слоев агарозы, покрьгваюш,их стеклянные шарики, Порат и др. [54] разработали очень простой и воспроизводимый метод активации в щелочном фосфатном растворе очень высокой буферной емкости при этом отпадает необходимость контроля pH и интенсивного перемешивания. Найдены условия для высокой, средней и низкой степеней активации, которые выбираются, исходя из природы связываемого аффинного лиганда. Кроме того для высокой степени активирования гелей, были выбраны условия как для гелей с низким содержанием агарозы [р=1—4%), так и с высоким (р = 4—8%) содержанием. Методики даны для гелей с разным содержанием р, %) агарозы в набухшем геле. [c.191]

Чаще всего связывание аффинного лиганда с агарозой проводят по методу, разработанному Аксеном, Поратом и Эрнбеком [4, 76]. После химической активации бромцианом в щелочной среде агароза ковалентно связывает соединения, содержащие первичные алифатические или ароматические аминогруппы. Степень активации, измеряемая по способности к связыванию небольших пептидов, пропорциональна значению pH в процессе активации [3], т. е. она растет с увеличением pH. Аксен и Эрнбек [3] иредложиши возможную схему процесса активации. [c.14]

Ряд алкилагароз со структурой СНз(СН2)пМН—сефароза (где п принимает значения от О до 7), и-аминоалкилагароз со структурой ЫН2(СН2)п ЫН—сефароза (где п — от 2 до 8) характеризуется близким содержанием алкильных боковых цепей на гранулу геля [15, 49]. В одинаковых условиях (pH, ионная сила, состав буферного раствора и температура) способность СНз(СН2)пЫН—сефарозы удерживать фосфорилазу Ь зависит от длины углеводородных цепей. При хроматографии на производных сефарозы (я = 0 или 1) фосфорилаза Ь выходила из колонки с фронтом растворителя при п = 2 происходила задержка фермента, а при п = 3 фермент адсорбировался. Элюирование фосфорилазы Ь с модифицированной сефарозы (п = 3) возможно с помощью деформирующих буферных растворов, которые, как было показано, приводят к обратимым структурным изменениям фермента. На производном сефарозы с л = 5 связывание фосфорилазы было настолько сильным, что фермент не элюировался с колонки, даже когда pH деформирующего буферного раствора понижался до 5,8, хотя деформирующая способность такого буфера намного выше. Освободить фосфорилазу Ь из комплекса с этим производным можно только в неактивной форме после промывки колонки 0,2 М уксусной кислотой. Сама агароза содержит отрицательные заряды, а связывание алкил- или ариламинов на активированной бромцианом агарозе вводит в гель положительные заряды (разд. 8.2.4). В связи с этим йост и др. [28] обращали внимание на то, что на сефарозе с алкиламинами, прикрепленными после предварительной активации носителя бромцианом, связывание белков происходит большей частью при pH выше изоэлектрической точки выделяемых белков. Поэтому допускалось, что в этих случаях электростатические взаимодействия с положительно заряженной Ы-замещенной изомочевиной более существенны для связывания, чем гидрофобные взаимодействия с гидрофобной боковой цепью. Тем не менее гранулы агарозы не связывают фосфорилазу Ь, пока к ним не будут прикреплены алкильные боковые цепи некоторой минимальной длины. Кроме того, отмеченные выше заряды в равной мере присутствуют во всех членах гомологического ряда, и, следовательно, они не могут быть причиной различий в степени [c.152]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология