Активация бромцианом

Расчет содержания иммобилизованных аффинных лигандов по анализу азота иногда приводит к ошибкам. Как уже обсуждалось в разд. 8.2.4, в ходе активации бромцианом в гель вводится азот количество последнего зависит от температуры, при которой проводится активация [53]. Однако содержание иммобилизованных белков, в особенности антител, часто рассчитывают по азоту, определяемому методом Кьельдаля [50]. [c.248]

Эффективная активность лиганда под влиянием иммобилизации может меняться самым различным образом. На взаимодействие иммобилизованного лиганда с выделяемыми молекулами может оказывать значительное очень разнообразное влияние микроокружение, образуемое матрицей (плотность заряда, стерические препятствия и т. д.) оно же может также влиять и на структуру аффинного лиганда. Иммобилизация приводит также к изменениям в химической структуре, которые различным образом изменяют его молекулярные свойства. Так, например, существенную роль играет число связей между аффинным лигандом и нерастворимым носителем. Из сопоставления результатов, представленных на рис. 10,10,6 и в, следует, что неблагоприятное влияние возрастающего числа связей между молекулами соевого ингибитора трипсина и сефарозой 4В вызвано увеличением pH с 7,2 до 8,5 во время связывания белка после активации бромцианом. [c.274]

Нативная сефароза или сефароза, блокированная этанолами-ном сразу же после активации бромцианом, не адсорбируют белки [16]. Однако, если сефароза не блокирована тотчас же после активации, наблюдается неспецифическая сорбция белков, которая становится тем сильнее, чем больше проходит времени между активацией бромцианом и блокированием активных центров. Препарат человеческий сывороточный альбумин—сефароза, блокированный после 12 ч после присоединения сывороточного альбумина,, сорбирует только 0,4 мг белка на 1 мл геля. [c.277]

Свойства гидроксильных групп этого геля аналогичны свойствам гидроксильных групп агарозы. После активации бромцианом они, как и гидроксильные группы сефарозы, могут связываться с аминогруппами белков [88]. [c.24]

Для хроматографии рибосомальной РНК и для выделения плазминогена ]1роизводится лизин—сефароза 4В путем связывания ь-лизина с сефарозой 4В после активации бромцианом. Концентрация связанного лизина составляет 4—5 мкмоль на 1 мл набухшего геля. Лизин—сефароза 4В поставляется в виде лио-филизованного норощка пакетах по 15 г, что эквивалентно 60 мл набухшего геля. Порошок содержит добавки для сохранения способности геля к набуханию. При хранении сухого геля при температурах <8°С не наблюдается никакой заметной потери связанного лиганда даже через 1 год хранения. [c.141]

В работе Лоу и др. [42] сопоставлены свойства сорбентов на основе целлюлозы и сефарозы, для чего использовались экспериментальные кривые титрования 6-аминогексил-МАО+—сефарозы, немодифицированной сефарозы, 6-аминогексаноил — сефарозы и соответствующих производных целлюлозы (рис. 8.1). Очевидно образование ионизирующих групп после активации бромцианом это было также показано в случае целлюлозы, когда для реакции присоединения использовали дициклогеисилкарбодиимид [38]. Отклонение, наблюдаемое для сефарозы, существенно меньше, [c.180]

Присоединение аффинных лигандов к декстрановым гелям может быть осуществлено с помощью ряда методов, описанных для целлюлозы, а также агарозы (см. ниже), а именно связывание после активации бромцианом, триазиновый метод, связывание с использованием эпоксидов или бифункциональных производных или связывание через ацилазидные промежуточные соединения. [c.183]

Стабильность матрицы агарозы можно значительно повысить путем сшивания эпихлоргидрином [34, 56], 2,3-дибромпропанолом [34, 36] или дивинилсульфоном [34, 58] перед активацией бромцианом. Устойчивость в водной среде как в кислой, так и в щелочной областях (pH 3—14) растет с увеличением числа сшивок. Возможность использования хаотропных солей, главным образом для элюирования антител, обсуждается в разд. 10.2. Благодаря сшиванию гели приобретают большую устойчивость в органических растворителях, таких, как спирт, диметилформамид, тетра-гидрофуран, ацетон, днметилсульфоксид, хлороформ, хлористый метилен, дихлорэтан и дихлорэтан — пиридин (1 1). [c.188]

Из работы Нишикавы и Бэйлона [49] следует важный вывод, касающийся этого метода и заключающийся в необходимости поддержания температуры между 4 и 10°С во время реакции активации бромцианом, в то время как реакция связывания аффинного лиганда может проводиться при комнатной температуре. В ряде гелей е-аминокапроновую кислоту связывали в различных условиях и определяли ее количество титрованием или по содержанию азота. Во всех случаях при действии бромциана включалось больше азота, чем можно было бы ожидать из содержания связанной е-аминокапроновой кислоты, определенной титрованием включение превышало расчет в отношении от 3 1 до 9 1. Превышение включения азота против расчетного возрастало с увеличением температуры активации (при 2°С оно составляло 3,3 раза, при 4°С—4,9 раза, а при 20°С—8,3 раза). Поскольку при 2 °С активация протекает очень медленно, такие условия нельзя использовать на практике. При 10 °С наилучшим образом сочетаются достаточно высокая скорость активации и минимальное число побочных процессов. Побочные реакции, сопровождаемые повышением содержания азота в препаратах иммобилизованных лигандов, являются одним из источников катионных групп, которые приводят к неспецифической сорбции. Этот вопрос детально обсуждается в разд. 10.3. Лоу и Дни [41] отмечали, что активированные гели содержат хотя и в небольших, но существенных количествах бром, что можно объяснить присутствием в препаратах бромциана трибромтриазина, который может участвовать в реакции связывания. [c.194]

Однако -нитрофенильную группу удалось заместить только на L-фенилаланин-п-нитроанилид или -лейцин-п-нитроанилид. Амидные связи в боковой цепи, которые образуются за счет специфической -аминокислоты, могут быть разрушены с помош,ью химо-трипсина как in vivo, так и in vitro. Платэ и Валуев [136] описали синтез афинных адсорбентов для биоспецифической хроматографии. Химическими методами осуществляется иммобилизация полимерных носителей путем связывания специфических лигандов с матрицей. После активации бромцианом протеин может быть связан с имидокарбонильной группой [c.101]

Чаще всего связывание аффинного лиганда с агарозой проводят по методу, разработанному Аксеном, Поратом и Эрнбеком [4, 76]. После химической активации бромцианом в щелочной среде агароза ковалентно связывает соединения, содержащие первичные алифатические или ароматические аминогруппы. Степень активации, измеряемая по способности к связыванию небольших пептидов, пропорциональна значению pH в процессе активации [3], т. е. она растет с увеличением pH. Аксен и Эрнбек [3] иредложиши возможную схему процесса активации. [c.14]

Активация бромцианом обычно требует высоких значений pH (10,5—11,5), но сочетание амина с активированным полисахаридом можно легко осуществить в 0,1М ЫаНСОз. Именно этот метод в основном используется при получении сорбентов для аффинной хроматографии ( uatre asas, 1970). [c.152]

Хотя активация агарозы бромцианом до сих пор остается наиболее широко применяемым методом, особенно при ее использовании для присоединения белков через е-лизиновые группы (см. разд. 4.7), в настоящее время разработаны и другие, более совершенные и эффективные методы, которые, безусловно, с успехом заменят активацию бромцианом. Первый метод — это эпоксиактивация , при которой в агарозу вводят эпоксидную группу, используя в качестве ее источника диглицидный эфир 1,4-бутандиола (бисскснран) (рис. 4.36) [78]. [c.150]

Исходным материалом может служить обычная или предварительно активированная агароза (активация бромцианом,. эпоксиактивация, а также введение карбонилдиимидазольных и тозильных групп) либо агароза, содержащая гексильную боковую цепь, оканчивающуюся карбоксильной группой или аминогруппой. Реакции с избытком лиганда или его аналога могут проходить в органических или водных растворителях — в зави- [c.159]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология