Денатурация окрашивание

Обычно белковые зоны обнаруживают путем окрашивания красителями. Когда для данного белка известна способность связывать краситель, возможно довольно хорошо оценить количественно получаемые результаты. Однако перед окрашиванием необходимо перевести белки в нерастворимое состояние химическим путем или при помощи тепловой денатурации — выдерживанием в течение [c.250]

Химические различия, выявляемые методами дифференциального окрашивания. Природа химических различий, выявляемых этими методами, еще только исследуется. Обычно обсуждаются две основные гипотезы так называемая ДНК-вая и белковая. Первая исходит из данных о том, что различные участки хромосом человека отличаются по количественному содержанию А—Т (аденин—тимин) и О—С (гуанин— цитозин) пар оснований. Акрихин-иприт связывается преимущественно с АТ-бога-тыми участками [466, 341]. Акридиновый оранжевый, соединяясь с одноцепочечной ДНК, дает красную флуоресценцию. После контролируемой денатурации К-сегменты окращиваются в красный цвет. На основании этих данных можно предложить [c.44]

Химические свойства. 1) Денатурация — разрушение вторичной и третичной структуры белка с сохранением первичной структуры. Происходит при нагревании или действии растворителей. 2) Гидролиз белков — разрушение первичной структуры в кислом или щелочном растворе с образованием аминокислот. 3) Качественная реакция на белки — красно-фиолетовое окрашивание при действии солей меди (П) в щелочном растворе (биуретовая реакция). [c.124]

Окрашивание белков обычно приводит к их денатурации и не позволяет получать точные количественные данные. В связи с этим были предприняты попытки выявлять белки и нуклеиновые кислоты по поглощению ими ультрафиолетового света. К тому же методы обнаружения нуклеиновых кислот в ультрафиолетовом свете, а белков по флуоресценции, как правило, более чувствительны, чем методы, основанные на связывании макромолекул с красителями. [c.181]

Чтобы определить, произошло ли лигирование, 5 -конец зонда X метят биотином, а З -конец зонда V — дигоксигенином, низкомолекулярным соединением, связывающимся с соответствующим антителом. После гибридизации и лигирования проводят денатурацию ДНК для высвобождения гибридизовавшегося зонда и переносят смесь в небольшую пластиковую лунку, покрытую стрептавидином. Лунку промывают, чтобы удалить весь материал, кроме связавшегося со стрептавидином биотинилированного зонда. Затем добавляют в лунку антитела к дигоксигенину, предварительно соединенные со щелочной фосфатазой. После промывания, в ходе которого происходит удаление несвязанного конъюгата, добавляют бесцветный хромогенный субстрат. Окрашивание раствора в лунке свидетельствует о связывании антитела к дигоксигенину с зондом, меченным дигоксигенином, т. е. о том, что этот зонд был лигирован с зондом, меченным биотином. Если же окрашивания не происходит, значит лигирования не было. [c.198]

Эта реакция катализируется цитохромоксидазрй мышц. На прокипяченной порции мышечной кашицы окрашивания не появляется вследствие тепловой денатурации фермента. [c.114]

Бумагу использовали в качестве пористой среды для изоэлектрического фракционирования в искусственных градиентах pH [115, 116], однако такая методика не получила распространения, частично из-за трудности создания искусственного градиента pH. Более удовлетворительные результаты получаются при использовании синтетических амфолитов-носителей, дающих естественный градиент pH. По сравнению с гелем бумага более удобна в обращении. Кроме того, здесь легче удалять амфолиты, поскольку белки могут быть подвергнуты тепловой денатурации непосредственно на бумаге к тому же белки легче снимаются с бумаги после фракционирования. Для. окрашивания белков на бумаге в присутствии амфолитов-носителей. применяют водный раствор, содержащий 0,05% бромфенолового синего, 1% хлористой ртути и 2% уксусной кислоты (117] при этом предварительно высушенную в сушильном шкафу электро-фореграмму погружают в горячий 10%-ный раствор ТХУ. Интенсивность окраски можно увеличить, выдерживая высушенную бумагу в атмосфере аммиака. [c.336]

Одним из недостатков бумаги является заметная адсорбция и денатурация белков на ней. Практически это явление всегда в той или иной мере имеет место. В этом отношении многообещающим является сравнительно новый листовой материал — пористая ацетат-целлюлозная пленка, применяемая обычно для изготовления мембранных фильтров. Начало применению этого материала было положено Коном в 1957 г. Сейчас некоторые фирмы производят листы довольно больших размеров (36x5 сж), хотя можно работать и с меньшими листками. Толщина листка такова (около 0,1 мм), что позволяет работать лишь с малыми количествами вещества (около 0,1—20 мкл раствора, содержащего 5— 500 мкг белка). Было показано, что адсорбция белка крайне мала, разделение обычно очень хорошее даже для тех белков, которые сильно адсорбируются на бумаге (инсулин, лизоцим). После окрашивания зон, погрузив листок в жидкость с показателем преломления, близким к 1,474, можно сделать его полностью прозрачным как для видимого света, так и для ультрафиолета, что облегчает количественный анализ. Подробное описание методики работы с ацетатом целлюлозы можно найти в работе [35]. [c.93]

С помощью одних и тех же антисывороток перекрестный ИЭФ позволяет выявить большее число антигенов, чем простой ИЭФ. Дополнительное преимущество — это возможность очистки антигенов. Наибольшая ценность перекрестного ИЭФ заключается в том, что он позволяет определять специфичность антител в неденатурирующих антигены условиях. В то же время электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ДСН с последующим Вестерн-блоттингом и иммунохимиче-ским окрашиванием хотя и обладает очень высокой чувствительностью, однако позволяет обнаружить только те антигенные эпитопы, которые не изменяются после денатурации. [c.228]

Использование ОФА для окрашивания комплексов белок— ДДС-Na перед их электрофорезом описано еще в 1973 г. [Wei-dekamm et al., 1973]. Реакцию проводили в 0,025 М Na-фосфатном буфере (pH 8,5) в присутствии 5% ДДС-Na и 2% р-меркап-тоэтанола. Сначала белок растворяли в этой смеси и прогревали при 100 для полной денатурации и восстановления, затем туда добавляли Vs объема 1%-ного раствора ОФА в метаноле и выдерживали в темноте 2—3 ч. [c.101]

РНК. Исследование содержания РНК в клетке может быть проведенб с помощью акридинового оранжевого (АО) после селективной денатурации двуспиральной РНК. Используются несколько способов соответствующей цитохимической обработки клеток [4, 5]. При этом на однонитчатой денатурированной РНК АО образует димеры, которые в отличие от мономерной формы красителя флюоресцируют в красной области спектра. Мономеры АО интеркалируют в неповрежденную биспиральную ДНК, и по интенсивности их зеленой флюоресценции можно оценивать содержание ДНК. Таким образом, это по существу метод двойного окрашивания и измерения содержания РНК—ДНК по красно-зеленой флюоресценции АО. Применяется также способ определения содержания РНК с помощью пиронина V [6, 7]. [c.140]

Перед окрашиванием белки необходимо фиксировать на носителе путем их денатурации в кислой среде (если они еще не денатурированы). Для фиксации обычно используют либо смесь метанол/уксусная кислота/вода в соотношении 3 1 6, либо-осадитель белка — трихлоруксусную кислоту, либо надхлорнук> кислоту в концентрации 5—10%. За исключением электрофоре- [c.325]

Правильность выделения специальной группы реовирусов стала очевидной, когда в начале 60-х гг. обнаружили уникальные особенности структуры реовирусной РНК. Сначала заметили, что при окрашивании клеток, зараженных реовирусами, акридиновым оранжевым наблюдается флуоресценция в зеленой области спектра (ортохроматическая), а не в оранжевой (мета-хроматическая), характерной для одноцепочечной РНК. Акридиновый оранжевый обладает высоким сродством к одноцепочечным нуклеиновым кислотам и окрашивает их метахроматически. Поскольку к тому времени уже было известно, что реовирусы содержат РНК, был сделан вывод, что эта РНК двухцепочечная [107]. Дальнейшие исследования показали, что реовирусная РНК состоит из комплементарных цепей, образующих двойную спираль [102, 157]. Для нее характерны высокая температура плавления и малый температурный интервал денатурации, устойчивость к панкреатической рибонуклеазе и иная, чем у одноцепочечной РНК, плавучая плотность. Определение нуклеотидного состава реовирусной РНК показало, что она содержит одинаковое число пуриновых и пиримидиновых оснований. Двухцепочечный характер реовирусной РНК был подтвержден также данными рентгеноструктурного анализа [16, 102]. [c.266]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология