Справочник химика 21

Химия и химическая технология

Статьи Рисунки Таблицы О сайте English

Фракционирование изоэлектрическое

    Высаливание лежит в основе одного из методов фракционирования высокомолекулярных веществ, поскольку способность этих соединений выделяться из раствора весьма сильно зависит от их химической природы и резко возрастает с увеличением молекулярного веса. Особенно широко применяется фракционирование с помощью высаливания для разделения белков. При этом высаливание часто сочетают с введением в систему нерастворителя (например, спирта) и охлаждением раствора. Высаливание белков целесообразно проводить при значении pH, близком к изоэлектрической точке, так как при значении pH, большем или меньшем изоэлектрической точки, возрастает заряд и гидратация белковых молекул и увеличивается их растворимость. [c.466]


    Основной метод выделения иммуноглобулинов является их фракционированное оса едение этшолом (по Е. Дж. Кону, 1945— 1946) на холоду при строгом контроле pH и ионной силы раствора. На процесс разделения белков сыворотки крови влияют следую- щие основные факторы концентрация белка, диэлектрическая постоянная раствора, концентрация этанола, изоэлектрическая. точка, pH, ионная хила раствфа, гешгератур . [c.588]

    Фракционирование белков на гидроксиапатите [23, 24] или геле фосфата кальция [25] является особой разновидностью ионообменной хроматографии. В этом случае разделение также основано на образовании электростатических связей между заряженными группировками молекул белков и ионами фосфата и кальция в кристаллах гидроксиапатита (ГА). Микрокристаллические частицы ГА состава Саю(Р04)б(0Н)2 или гель фосфата кальция фиксированы обычно на инертном носителе, например целлюлозе. ГА амфотерен, его изоэлектрическая точка сильно зависит от метода получения она может находиться в диапазоне от 6,5 до 10,2. На прочность связывания положительно заряженных группировок оказывают сильное влияние неорганические соли прочность связывания отрицательно заряженных групп практически не зависит от концентрации солей. Кроме того, сорбция в присутствии солей зависит и от молекулярной массы белка. Различные аспекты применения ГА для [c.437]

    Значение pH раствора полиамфолита, при котором средний суммарный заряд на цепи равен нулю, называется изоэлектрической точкой (ИЭТ). Величина ИЭТ не зависит от концентрации полиамфолита и является важной константой полиамфолита. На различии в ИЭТ основано фракционирование смесей белков, например, методом электрофореза. При определении ИЭТ учитывается суммарный заряд макромолекул, обусловленный не только диссоциацией кислотных и основных групп полиамфолита, но и специфическим связыванием посторонних ионов из раствора. ИЭТ определяется с помощью электрокинетических методов (в частности, электрофореза) либо косвенным путем по изменению свойств, связанных с зарядом макромолекул. Значения степени набухания, растворимости полиамфолитов, осмотического давления и вязкости их растворов в ИЭТ проходят через минимум. Вязкость в ИЭТ минимальна (рис. IV. 7), поскольку вследствие взаимного притяжения присутствующих в равном количестве противоположно заряженных групп полимерная цепь принимает относительно свернутую конформацию. При удалении от ИЭТ цепь полиамфолита приобретает суммарный положительный (в кислой области pH) или отрицательный (в щелочной области pH) заряд [c.127]


    Фракционирование белков можно осуществить методом изоэлектрического фокусирования. В этом случае электрофорез белков проводят в колонке со средой, в которой градиентно меняется значение pH. Там, где pH среды соответствует ИЭТ данного белка, он теряет заряд и перестает продвигаться вдоль колонки. Таким [c.122]

    Электрофокусирование представляет собой миграцию молекул амфолита в градиенте pH под действием постоянного напряжения в область со значением pH, равным изоэлектрической точке вещества. Это явление известно довольно давно, однако до последнего времени все попытки применить его для фракционирования белков оставались в значительной мере безуспешными, главным образом из-за трудности создания удовлетворительного градиента pH. Эта задача была решена несколько лет назад благодаря применению синтетических амфолитов-носите-лей. В результате этого электрофокусирование прочно утвердилось как важный метод фракционирования белков. В 1967— 1968 гг. появилось описание метода примерно в 60 работах, что превысило число публикаций, посвященных предшествующим вариантам электрофокусирования, за последние 50 лет. [c.297]

    На протяжении всей главы наряду с понятием электрофокусирование будет использоваться термин изоэлектрическое фокусирование . Для этой цели применяли и множество других терминов изоэлектрическое фракционирование, изоэлектрическое конденсирование, стационарный электролиз, непрерывный электролиз, изоэлектрический равновесный электрофорез. [c.298]

    ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ (ФОКУСИРОВАНИЕ) [c.318]

    Следует особо указать на различие между изоэлектрическим фокусированием и электрофорезом. Спектр подвижности , создаваемый с помощью электрофореза, представляет собой картину распределения белков по величине молекул и суммарному заряду при данном значении pH. Существенное преимущество изоэлектрического фокусирования по сравнению с другими методами фракционирования состоит в том, что в ходе разделения зона белка сжимается, поскольку действующие силы стремятся уменьшить размывание зон вследствие диффузии. [c.299]

    Методы создания градиента pH подразделяются [9] на создание искусственного и естественного градиента. Искусственный градиент pH возникает при постепенном перемешивании наслоенных друг на друга двух буферных растворов, различающихся как по плотности, так и по величине pH. Однако при подаче на такую систему напряжения ионы начинают мигрировать, что приводит к быстрому смещению градиента. Ввиду нестабильности в электрическом поле искусственный градиент pH непригоден для изоэлектрического фокусирования в течение длительного времени. Все же Колин [8, 10] использовал искусственный градиент pH для изоэлектрического фракционирования гемоглобина, каталазы и цитохрома с. Факт разделения он зарегистрировал через 4 мин после начала электролиза прямой фотосъемкой, однако такой процесс не мог продолжаться более длительное время. [c.300]

    ТЕОРИЯ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ [c.318]

    ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ В ЖИДКОЙ СРЕДЕ [c.319]

    Изоэлектрическое фракционирование можно проводить в такой среде, в которой осаждению зон макромолекул препятствует резкий градиент плотности среды. Большее число фракций можно получить просто за счет вытекания их из прибора. Другое преимущество метода — возможность точного измерения гра- [c.319]

Рис. 12.17. Аппарат для препаративного изоэлектрического фракционирования Рис. 12.17. Аппарат для препаративного изоэлектрического фракционирования
    Ионная сила раствора имеет большое значение при растворении и выделении белков, их очистке, фракционировании и электрохимических исследованиях (электрофорез, определение изоэлектрической точки). [c.60]

    Фракционирование путем электрофореза представляет собой суммарный результат действия многих факторов, некоторые из которых противоположны друг другу. При электроэндоосмосе присутствие фиксированных зарядов на мембранной или гелевой матрице может вызывать результирующий поток воды в направлении, противоположном направлению миграции белков. В зависимости от изоэлектрической точки данного белка и состава буферного раствора белок может быть нейтральным, чисто катионным или чисто анионным. Суммарный заряд белка будет определять скорость и направление его передвижения. Вследствие того, что электрофорез дает возможность разделять материалы биологического происхождения, представляющие интерес для биоинженерных исследований, можно прогнозировать, что эта область применения электрофореза будет развиваться самостоятельно, наряду с широким использованием указанного метода и для аналитических целей. [c.89]

    В данной области ионитовые мембраны получили значительно большее распространение, чем в электрохимическом синтезе органических соединений. Их используют для деминерализации растворов органических соединений, т. е. для освобождения последних от минеральных кислот или солей. Значительный интерес представляет и разделение органических соединений с помощью электродиализа, например процесс фракционирования аминокислот, основанный на различии их изоэлектрических точек, а следовательно, и ионного состава. [c.255]


    Изоэлектрическое фокусирование — это один из новейших методов разделения молекул, основанных на их поведении в электрическом поле. Во время изоэлектрического фокусирования между анодом и катодом создается градиент pH. Заряженные молекулы, которые вначале равномерно распределены в среде или нанесены в виде одной полосы, движутся в соответствии с их фактическим зарядом в направлении противоположно за-ряжен1 0Г0 электрода. Если эти молекулы амфотерны, то при перемещешш в градиенте pH их суммарный заряд будет непрерывно меняться до тех пор, пока они не достигнут положения, где он станет равным нулю. Это произойдет в том месте градиента pH, в котором значение pH окажется равным изо-электрической точке молекулы. Таким образом, молекулы, имеющие одинаковую изоэлектрическую точку, сконцентрируются в узкой зоне. Если градиент pH стабилен, то дальнейших изменений происходить не будет и молекулы останутся сконцентрированными, так как их диффузии препятствует электрическое поле. Чаще всего этот процесс называют изоэлектрическим фокусированием (ИЭФ), однако в литературе можно встретить и такие термины, как изоэлектрическое фракционирование, изоэлектрическое разделение, изоэлектрическая конденсация и стационарный электролиз. [c.124]

    Потери аминокислот, частично проходящих в анодную и катодную секции, не распределяются равномерно между ними. Ампнокнслоты с высокой изоэлектрической точкой попадают преимущественно в крод-ную секцию, а аминокислоты с низкой изоэлектрической точкой — в анодную. Этот эффект может быть положен в основу фракционирования аминокислот. Лауч и другие [141 применили метод миграции ионов вдоль мембраны под действием стационарного электрического поля для разделения аминокислот по подвижностям, однако только Тракслеру удалось создать простой и удобный метод фракционирования аминокислот 151. Аппарат, который применял Тракслер, изображен на рис. 2. [c.73]

    Далее следует сделать выбор между аниона- и катионообменни-ком. При фракционировании определенным образом заряженных молекул такой выбор не представляет труда. Например, очевидно, что олигонуклеотиды следует делить на анионообменнике, а заведомо щелочные белки, например гистоны,— на катпонообменнике. Для амфотерных молекул посредством выбора pH буфера можно задавать знак суммарного заряда и таким образом определять нужный тип ионообменника. Здесь решающим соображением может оказаться учет диапазона pH, в котором препарат (например, белок) сохраняет свою нативность, не склонен к агрегации или неспецифической сорбции. Если такой диапазон pH располагается по обе стороны от изоэлектрической точки очищаемого компонента исходной смеси, то выбор типа обменника может диктоваться оптимизацией условий разделения, как было пояснено выше, в разделе Хроматографический процесс . [c.287]

    Для фракционирования белковых смесей, находящихся в растворе, широкое применение получили методы дробного осаждения, основанные на изменении растворимости белков в присутствии растворов солей и органических растворителей. При фракционировании солями чаще всего используют сернокислый аммоний, позволяющий создавать высокую ионную силу раствора при низкой температуре, а из органических растворителей — этиловый спирт и ацетон. На различиях в растворимости белков основано и изоэлектрическое осаждение, достигаемое за счет минимальной растворимости глобулярных белков в изоэлектричес-кой точке. В последние годы для фракционирования белков все чаще находят применение центрифугирование, избирательная адсорбция, различные виды хроматографии и электрофореза. [c.88]

    Как известно, амфотерными электролитами, кроме ионов некоторых простых элементов, являются аминокислоты. Впервые Аструп и Стаге [10] предложили метод обессоливания аминокислот с применением ионитовых мембран, т. е. метод фракционирования пеамфотерных неорганических солей и амфотерных аминокислот. Хорошие результаты получили Ди Бенедетто и Лайтфут [Ц] по разделению глицина и хлор-иона. В проведенных ими опытах перенос глицина при pH, близких к его изоэлектрической точке, был около 6,1% при pH = 9 перенос возрастал до 15,7% а при pH =11,3 —до 51%. [c.72]

    Величины О и йи1й рН) отражают свойства разделяемого вещества. Из уравнений (2) и (3) следует, что узкие зоны должны получаться при фракционировании веществ с низкими коэффициентами диффузии и крутым подъемом кривой подвижности вблизи изоточки. Именно эти свойства характерны для белков, что делает их наиболее удобными объектами изоэлектрического фокусирования. Кроме того, вполне очевидно, что для достижения хорошего разрешения необходимо использовать высокое напряжение и пологий градиент pH. В соответствии с этим при конструировании прибора необходимо предусмотреть отвод тепла, а также возможность создания пологого и стабильного градиента pH в среде, обладающей хорошей проводимостью. [c.300]

    Бумагу использовали в качестве пористой среды для изоэлектрического фракционирования в искусственных градиентах pH [115, 116], однако такая методика не получила распространения, частично из-за трудности создания искусственного градиента pH. Более удовлетворительные результаты получаются при использовании синтетических амфолитов-носителей, дающих естественный градиент pH. По сравнению с гелем бумага более удобна в обращении. Кроме того, здесь легче удалять амфолиты, поскольку белки могут быть подвергнуты тепловой денатурации непосредственно на бумаге к тому же белки легче снимаются с бумаги после фракционирования. Для. окрашивания белков на бумаге в присутствии амфолитов-носителей. применяют водный раствор, содержащий 0,05% бромфенолового синего, 1% хлористой ртути и 2% уксусной кислоты (117] при этом предварительно высушенную в сушильном шкафу электро-фореграмму погружают в горячий 10%-ный раствор ТХУ. Интенсивность окраски можно увеличить, выдерживая высушенную бумагу в атмосфере аммиака. [c.336]

    Фракционирование элёктрофокусированием основывается, по-видимому, исключительно на различии в изоэлектрических точках, Большинство других методов используют различие в одном или нескольких иных свойствах, например растворимости, размерах, форме или заряде молекул. (Исключение составляют элюирование в градиенте pH на ионообменниках [119] и электродекантация [120].) Поскольку при разделении белков электрофокусированием используются различные свойства этих соединений, можно надеяться, что набор разделяемых компонентов в этом случае будет иным, чем при разделении другими методами. Иногда так и получается [30, 88, 94], но не в случае сходных белков, например изоферментов [25, 26, 32]. [c.337]

    В изоэлектрическом фракционировании, или фокусировании, сокращенно ИФ) используется градиент концентрации ионов, который влияет на заряд разделяемых компонентов, например Н+ и комплексообразующих ионов. Самый обычный пример — ИФ амфотерных макромолекул, главным образом белков при градиентном изменении pH. Белки значительно различаются по своим изоэлектрическим точкам, т. е. по значениям pH, при которых они имеют нулевой заряд. При pH меньшем, чем изоэлек-трическая точка, белок приобретает положительный заряд, и поэтому движется в электрическом поле как катион. При наличии градиента pH, который увеличивается от анода к катоду, ион движется к точке, у которой он потеряет свой положительный заряд или станет полностью электрически нейтральным. Такой градиент pH можно создать с помощью системы буферных растворов. Однако описанный метод не нашел широкого применения. Свенсон [95] теоретически обосновал и подтвердил практически преимущества применения устойчивого естественного градиента pH. Градиент такого типа наблюдается при электролизе смеси амфотерных веществ. Стационарное состояние устанавливается в том случае, когда амфолиты располагаются в порядке увеличения изоэлектрической точки р1 от самого низкого значения (вблизи анода) до самого высокого (вблизи катода). Практическое использование этого метода возможно при подборе подходящей смеси амфолитов-носителей. Амфолиты долж- [c.318]

    Миграция амфотерных соединений в условиях ИФ до такого положения, в котором молекула имеет нулевой суммарный заряд, конкурирует с тенденцией зон расширяться вследствие диффузии. Увеличение градиента напряжения усиливает фокусирующий эффект до тех пор, пока джоулево тепло не вызывает смешения зон под действием тепловой диффузии и конвекции или не приведет к денатурации природных амфотерных макромолекул. Теория этого процесса была разработана Свенсоном [96]. И буферная емкость, и необходимая электропроводность амфолитов увеличиваются по мере уменьшения разности между р/ и рК. Когда эта разность становится равной единице, сохраняется 25% максимальной буферной емкости, но при равности близкой к 2, остается только 3% буферной емкости. Величина разности в 1,5—2 ед. pH является пределом, до которого амфолиты используются в качестве среды для изоэлектрического фракционирования. [c.319]

Рис. 12.16. Выделение компонентов бычьего а-кристаллина методом изоэлектрического фракционирования при градиенте плотности [5]. Рис. 12.16. <a href="/info/284984">Выделение компонентов</a> бычьего а-кристаллина <a href="/info/995842">методом изоэлектрического</a> фракционирования при градиенте плотности [5].
    В настоящее время трудно еще интерпретировать результаты, получаемые при фракционированном осаждении белков плазмы. Мы не можем еще с достаточной уверенностью сказать, существуют ли все эти фракции как таковые в самой плазме крови, а также решить вопрос о возможности их дальнейшего разделения. Всего вероятнее, что белки плазмы находятся в плазме в виде соединений с липидами, у1 леводами, а также друг с другом . Так, например, можно думать, что -глобулины, изоэлектрическая точка которых лежи г около pH 7,0, дают солеобразного тина соединения с альбуминами, изоэлектрическая точка которых находится вблизи pH 4,7. Возможно также, что белковые компоненты липопротеинов и глюкопротеидов плазмы идентичны [c.177]

    Несмотря на то, что яичный альбумин образует прекрасные кристаллы, он не является однородным веществом и состоит, по данным электрофоретического анализа, по крайней мере, из двух фракций [148, 149]. Яичный альбумин составляет примерно 50% общего количества всех белков яичного белка курицы 15% приходится на долю кональбулшна — белка, остающегося в фильтрате после осаждения кристаллов яичного альбумина [150]. Ко-нальбумин можно получить непосредственно из яичного белка путем фракционирования разбавленным этиловым спиртом [151]. Он оказался флавопротеином с молекулярным весом 87 ООО и изоэлектрической точкой, лежащей при pH 6,1 с солями железа кональбумин образует комплекс красного цвета (см. стр. 239). Из яичного белка можно еще выделить глобулин, который получил название яичного глобулина, однако о его свойствах известно мало [152]. [c.194]

    Ионообменное фракционирование протеинов. Фракционирование протеинов плазмы крови с использованием ионитов было разработано Рейдо.м и Джонсом В7, 68, 69]. Метод основан на принципе осаждения протеинов обессоливанием, при котором уменьшается ионная сила раствора он дает результат, аналогичный диализу или разбавлению с изоэлектрическим корректированием pH и не имеет недостаттков, свойственных таким методам, особенно в большом масштабе [70]. При периодическом добавлении катионита и анионита (в смеси или отдельно) к сыворотке протоплазмы или при пропускании раствора протеина через колонну с обоими ионитами в пределах pH = 6—8 происходит осаждение некоторых протеинов, так как ионная сила раствора непрерывно понижается. Разделение осадков, образовавшихся при определенной заданное ионной силе, позволяет выделить из плазмы или сыворотки фракции глобулярных протеинов, богатых каким-либо одним компонентом в жидкой фазе основным компонентом является альбумин. [c.616]


Смотреть страницы где упоминается термин Фракционирование изоэлектрическое: [c.127]    [c.238]    [c.95]    [c.302]    [c.335]    [c.23]    [c.194]    [c.310]    [c.321]    [c.323]    [c.30]    [c.229]    [c.356]    [c.238]   
Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам Часть 2 (1982) -- [ c.0 ]




ПОИСК







© 2025 chem21.info Реклама на сайте