Справочник химика 21

Химия и химическая технология

Статьи Рисунки Таблицы О сайте English

Флуоресценция, измерение при определении ферментов

    Хотя в последние годы опубликовано немало статей, описывающих преимущества ФИА, соответствующие наборы и приборы стали выпускать в промышленном масштабе только недавно. Флуоресцентные метки значительно дешевле изотопных, срок годности наборов ФИА намного больше, чем наборов РИА, а флуоресценцию можно измерять на простых флуориметрах. Многие достоинства ФИА свойственны и методам ИФА (доступность методик ковалентного связывания ферментов с антигенами или антителами, стабильность меченых продуктов, безопасность и др.). Главный недостаток ИФА связан со способом измерения результата анализа, а именно с необходимостью дополнительной операции определения активности фермента с помощью соответствующего субстрата. Эта операция усложняет и замедляет анализ и в принципе может сни- [c.139]


    На практике при проведении ферментативной реакции на последней стадии иммуноферментного анализа обычно измеряют не скорость ферментативной реакции, а оптическую плотность или флуоресценцию продукта через определенный фиксированный промежуток времени. Для того чтобы такое измерение было эквивалентно определению скорости реакции, необходимо, чтобы кинетические зависимости накопления продукта реакции от времени имели вид прямых во всем временном диапазоне. В таком случае оптическая плотность раствора (или интенсивность флуоресценции продукта реакции), измеренная через фиксированный интервал времени после начала ферментативной реакции, будет реально отражать концентрацию фермента в системе. Так как скорость реакции, согласно уравнению (4.7), сильно зависит от концентрации субстрата, проводить ее следует на такую глубину, чтобы можно было пренебречь расходованием субстрата в ходе ферментативной реакции (т. е. выполнялось условие [SJo onst), В противном случае ввиду уменьшения концентрации субстрата в системе скорость ферментативной реакции будет постепенно падать, а следовательно, измеряемая через фиксированный промежуток времени оптическая плотность не будёт отражать истинную концентрацию фермента в растворе. [c.62]

    Авторы одной из работ (Neurath, Stri k, 1981) сообщают о том, что замена хромогенного субстрата на флуорогенный позволяет повысить чувствительность определения -галактозидазы на три порядка. Теоретически это должно означать, что применение флуориметрии вместо колориметрии при проведении ИФА с использованием -галактозидазы в качестве индикаторного фермента может в тысячу раз снизить предел обнаружения антигена. В действительности несмотря на то, что флуориметрический вариант ИФА, который авторы использовали для обнаружения поверхностного антигена вируса гепатита В человека, был примерно на два порядка более чувствительным, чем РИА, им не удалось достичь предельной чувствительности, предсказанной на основании данных по предельной чувствительности определения самого фермента. Оказалось, что чувствительность ограничивается фоновой флуоресценцией, наблюдаемой для образцов, не содержащих антигена. Фоновая флуоресценция может быть вызвана неспецифическим связыванием использованных антител. В таком случае повышения чувствительности можно достичь, только повышая специфичность собственно иммунохимических компонентов системы. Другое возможное объяснение связывает фоновую флуоресценцию с присутствием в реакционной смеси флуоресцирующих примесей. В этом случае следует использовать более чистые реагенты и (или) проводить окончательные измерения флуорес- [c.289]


    Согласно другой процедуре, реагенты частично иммобилизуются для этого их вносят в раствор, полимеризующийся затем с образованием геля (например, геля агара, который помещают на поверхность электрофоретического геля) или ими пропиты-.вают фильтровальную бумагу. В этих случаях можно локализовать сложную цепь реакций, инициируемых определяемым фер- ментом, так как даже тогда, когда видимый продукт растворим, он не может быстро диффундировать наружу. Процессы, ана- логичные тем, которые протекают при измерении ферментативной активности сопряженными методами (см. разд. 8.3), тоже можно использовать для локализации ферментов так, образование или окисление NAD(P)H можно наблюдать в ближнем ультрафиолете (сине-зеленая флуоресценция). Для качественного обнаружения ферментов в геле часто применяют такие химические методы, которые обычно не используются для определения ферментативной активности в растворе. Например, освобождение фосфата под действием различных фосфатаз может быть замечено по появлению осадка фосфата кальция [192]. Если же этот осадок не очень отчетливо виден, то после отмывания избытка реагентов его можно превратить в фосфат евин- [c.328]

    НОГО С белком динуклеотида обусловливает значительную интенсификацию излучения (увеличение квантового выхода), вследствие чего измерение флуоресценции — особенно чувствительный метод для обнаружения комплекса между ферментом и коферментом. Связывание восстановленного никотинамиднуклеотида с определенным флавопротеидом приводит к гашению флуоресценции рибофлавином посредством механизма, аналогичного действующему в растворах динуклеотида. [c.465]

    Д. Миозиновая АТРаза определение констант скорости ассоциации и диссоциации фермент-субстратного комплекса, исследование промежуточных конформационных состояний и равновесий методом остановленной струи с регистрацией флуоресценции, методом высвобождения протонов, измерением ферментативной активности при помощи вспомогательных ферментных систем, методом светорассеяния и методом замороженной струи [c.238]


Смотреть страницы где упоминается термин Флуоресценция, измерение при определении ферментов: [c.104]    [c.104]   
Ферменты Т.3 (1982) -- [ c.40 ]




ПОИСК





Смотрите так же термины и статьи:

Ферменты определение

Флуоресценция



© 2025 chem21.info Реклама на сайте