Ферментативная активность, количественное определение

Рис. 9-7. Количественное определение ферментативной активности. Эта процедура проводится в три этапа 1) определение /С (рис. 9-4 и дополнение 9-2), 2) измерение начальных скоростей (А) при различных концентрациях фермента и при концентрации субстрата, близкой к насыщающей, например при концентрации, равной 10 Км.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ И АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ [c.67]

Определение количественного содержания ферментов в биологических объектах представляет известные трудности, поскольку, за редким исключением, ферменты в тканях присутствуют в ничтожно малых концентрациях. Поэтому о количестве ферментов судят по скорости катализируемой реакции в определенных, согласованных условиях измерения. При оптимальных условиях температуры, pH среды и полном насыщении фермента субстратом скорость катализируемой реакции пропорциональна концентрации фермента. О скорости ферментативной реакции судят или по скорости убыли субстрата, или по скорости образования продукта реакции. Для выражения концентрации фермента и количественной оценки его активности в условных единицах Комиссией по ферментам Международного биохимического союза была рекомендована стандартная международная единица (Е или Ц) за единицу активности любого фермента принимается то количество его, которое в оптимальных условиях катализирует превращение 1 микромоля субстрата или образование 1 микромоля продукта в минуту (мкмоль/мин) . [c.157]

Наличие у мальтозы редуцирующей способности делает возможным количественное ее определение в растворе. Таким образом, по скорости образования мальтозы из крахмала в присутствии исследуемой вытяжки можно судить об интенсивности процесса осахаривания крахмала и, следовательно, о ферментативной активности амилазы в исследуемой жидкости. [c.123]

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ [c.68]

В основе всякого количественного определения ферментативного действия или активности действия фермента лежат те изменения, которые происходят с субстратом соответствующей ферментативной реакции. Об этих изменениях и об их скорости можно судить либо по исчезновению исходных веществ, подвергающихся ферментативному воздействию, либо по образовани и накоплению продуктов ферментативной реакции. [c.67]

Используя ДНК-содержащие микрогели и галлоцианин как краситель, можно обнаружить 0,1 нг дезоксирибонуклеазы [1482]. Применение для фракционирования дезоксирибонуклеаз полиакриламидного геля, содержащего Н-ДНК, улучшает результаты их количественного определения. После электрофореза гели разрезают и инкубируют в соответствующем буфере. Ферментативную активность определяют по количеству выходящих в среду радиоактивных фрагментов. Величина этой радиоактивности пропорциональна количеству фермента в пределах от 10 до 0,1 нг, а воспроизводимость определений составляет 5%. [c.295]

Пример количественного анализа ферментативной активности определение содержания дегидрогеназы [c.68]

Количественное определение ферментативной активности 68 [c.376]

Количественно У. к. определяют после их выделения специфич. реакциями на сахара или уридин, или определением их коферментной активности в соответствующих ферментативных процессах. [c.181]

Действие фосфора на интенсивность передвижения углеводов у картофеля коррелирует определенным образом с изменениями в направленности ферментативных превращений крахмала. Не обнаружено такого соответствия с влиянием на активность ферментов, синтезирующих и расщепляющих сахарозу. Установленные особенности в действии суперфосфата связаны, видимо, с тем, что у картофеля количественно преобладающей формой углеводов является крахмал. [c.240]

На заключительной стадии проведения ИФА осуществляется измерение каталитической активности ферментной метки. При наличии отработанной методики анализа регистрируемый при этом параметр однозначно соответствует начальной концентрации измеряемого соединения и служит характеристикой его содержания. Единицы, в которых выражается регистрируемый сигнал, могут быть различны и зависят от метода определения ферментативной актив-сти (например, спектрофотометрический, флуориметрический, электрохимический, люминесцентный и т.д.). На основании полученных данных оператор должен сделать вывод, присутствует ли анализируемое соединение в пробе, и если да, то в какой концентрации. Этот этап является крайне ответственным, и для того чтобы максимально снизить возможность субъективных оценок результатов анализа, современные регистрирующие приборы для проведения ИФА оснащены микропроцессорами, с помощью которых рассчитывают концентрацию определяемого соединения в соответствии с заданной программой. Но пока что в большинстве случаев количественная интерпретация результатов зависит от опыта сотрудника, проводящего анализ. [c.256]

Оригинальный прием хроматографического разделения энантиомеров использован в работе [296[. Ее авторы применили хроматографическую колонку, заполненную силикагелем с привитыми протеазами трипсином и а-химотрипсином, для разделения метиловых эфиров В,Ь-аминокислот. При этом в полной мере реализуется стереоспецифическая способность данных ферментов к расщеплению эфирных связей только в эфирах Ь-аминокислот. При введении в хроматографическую колонку (авторы называют ее ферментативным реактором) смеси метиловых эфиров В,Ь-аминокислот происходит количественный ферментативный гидролиз Ь-формы. Высокая условная энантиоселективность разделения для ароматических кислот от 2,5 до 17,6 связана не столько с селективным распознаванием, сколько с заметными различиями в хроматографических свойствах свободной аминокислоты и ее метилового эфира. Другой, не менее эффективной, возможностью создания белковых хиральных фаз может оказаться закрепление на поверхности силикагеля моноклональных антител на определенный хиральный оптически активный субстрат, хотя в этом случае может возникнуть вопрос об универсальности использования таких сорбентов. [c.448]

Известны два основных метода деградации белковой молекулы — частичный кислотный гидролиз и ферментативный гидролиз. Первый метод менее селективен, по с его помощью могут быть получены ценные данные относительно структуры низкомолекулярных белков определенного молекулярного веса. Полный гидро.-лиз белков до составляющих аминокислот не позволяет установить последовательность расположения аминокислот в белке. Однако количественное определение соотношений отдельных аминокислотных, остатков дает возможность судить о гомогенности данного белка. На основе этих данных можно рассчитать эмпирические формулы и сравнить их с формулами, полученными нри помощи элементарного анализа. Это необходимо сделать до проведения частичного гидролиза белка или его ступенчатого расщепления для определения последовательности аминокислот. Подобная методика приведена в статьях Белла и сотр., посвященных определению структуры одного из физиологически активных компонентов кортикотронина [И, 25, 152, 153]. [c.392]

Попытки непосредственно показать взаимопревращение пи-ридоксаминфосфат-ферменга и пиридоксальфосфат-фермента до сих пор были безуспешными , по-видимому, вследствие ряда экспериментальных трудностей, обусловленных тем, что в соединение с ферментом вступает лишь очень небольшое количество кофермента и при этом отсутствует достаточно хороший метод количественного отщепления и определения связанного с ферментом кофермента. Задача осложняется еще и тем, что добавленный синтетический кофермент может присоединяться к белковой молекуле фермента не только там, где он необходим для проявления ферментативной активности, но и в других ее участках. Исследования с применением кофермента, меченного радиоактивным фосфором, позволили обнаружить неспецифическое [c.251]

Наличие йода и нитрогруппы в пара-положении к тетразо-цепи придает ИНТ высокую чувствительность к восстановлению [67—70]. Поэтому ИНТ может с успехом применяться для количественного определения ферментативной активности, основанного на вымывании образующегося из ИНТ формазана органическим растворителем и его кoлopимeтpиpoвa НИИ [71]. ИНТ применяют также при исследованиях функции печени, почек, сердца [72], растительных и животных опухолей [73], [68], для определения качества свежезамороженной рыбы, основанного на количественном определении ферменг тов, выделяемых гнилостными бактериями на поверхности рыбы [74], для локализации моноаминооксидазной активности [75]. [c.136]

Ферментативная активность церулоплазмина была впервые описана Холмбергом и Лоуреллом [46], которые показали, что это единственный фермент, катализирующий окисление полиаминов и полифенолов в плазме. Катализируемая церулоплазмином реакция окисления п-фенилендиамина и других аналогичных соединений используется обычно для количественного определения белка в растворе [31, 47, 48]. Однако не было замечено, чтобы церулоплазмин играл сколь-нибудь существенную физиологическую роль при окислении таких важных биологических субстратов, как адреналин, норадреналин, серотонин, катехоламин или допамин [49]. [c.369]

При изучении гомогенности можно отдать предпочтение любой легко определяемой биологической активности, особенно ферментативной активности, которая имеется в исходном материале и относительно которой можно определенно предполагать, что она не связана с изучаемым гликонротеи-ном [601. Например, сыворотка эмбриона теленка содержит вещество, которое способствует соединению клеток данной культуры, и эта биологическая активность была использована Спиро [901 как показатель гомогенности препаратов фетуина. Фетуин не обладает этой активностью, хотя она сопровождает его на ранних стадиях фракционирования. Проба на ферментативную или иную постороннюю биологическую активность является ценной для установления гомогенности конечного продукта только тогда, когда показано, что в используемых условиях фракционирования не происходит инактивации. Полученные этим путем доказательства еще более вески, если можно показать, что фермелтативнан или иная активность количественно удалена в побочных фракциях. [c.55]

В большинстве случаев способ обнаружения фермента состоит в том, что электрофореграмму разрезают на небольшие участки, элюируют из них фермент и определяют его активность обычными методами. Такая методика позволяет проводить количественное определение ферментативной активности, однако иногда при этом снижается степень разрешения, поскольку фрагменты геля, как правило, шире, чем зоны разделенных белков. С точки зрения разрешающей способности более предпочтительными являются методы локализации ферментов in situ. Краткое описание таких методов дается в настоящей главе. [c.279]

ВОЛЬНО часто, проблеме количественного анализа энзимограмм до сих пор уделялось сравнительно мало внимания. При этом нередко применяют методы, широко используемые для определения белков в зонах, окрашенных специфическими белковыми красителями. Энзимограммы сканируют с помощью денситометров и вычисляют площади пиков, которые служат мерой ферментативной активности. Другие методы количественной оценки ферментов- основаны на элюции и последующем определении ферментативной активности в растворе или на элюции окрашенного продукта, образовавшегося под действием фермента in situ. [c.282]

Фриц и др. 408] обнаружили, что соотношение между изоферментами ЛДГ, выявленными с помощью электрофореза в геле и последующего специфического окрашивания разделенных зон, зависит от количества нанесенного на гель белка. Более того, соотношение изоферментов, определенное при электрофорезе, отличается от их соотношения при измерении другими методами. Меньшие количества фермента обнаруживали более высокую относительную активность, что, вероятно, объясняется медленным проникновением в гель субстрата и сопрягающего агента. При электрофорезе в микрогелях изоферментов глюко-зо-6-фосфатдегидрогеназы подобных отклонений не наблюдалось [257]. В этом случае субстраты, коферменты, сопрягающие агенты и другие низкомолекулярные соединения очень быстро проникают в гель, благодаря чему обеспечивается постоянный избыток субстрата и других реагентов. Таким образом, микрогель можно рассматривать как микрокювету и использовать его для количественного определения пикограммовых количеств ферментов, а также для изучения кинетики ферментативных реакций. Детальное описание этих методов дается в работе Нейхоффа [915]. [c.283]

Другие методики. Когда определение ферментативной активности или прямые измерения радиоактивности не подходят для контроля элюирования, следует рассмотреть другие возможности для анализа связывания. Наибольшего внимания в качестве общего чувствительного метода количественного измерения подвижного компонента заслуживает, по-видимому, радиоиммуноанализ. Кроме того, может оказаться целесообразным измерение количества элюированного подвижного компонента с помощью количественного лигандсвязывающего анализа, например в случае доступности радиоактивно меченного лиганда, аналогичного по структуре иммобилизованному лиганду. [c.232]

Методы иммуноанализа, предназначенные для нелабораторного использования, должны требовать лишь минимальной калибровки или вовсе ее не требовать и должны давать надежные результаты при самых разных внешних условиях. Можно ожидать, что иммунохроматографический анализ мало чувствителен к продолжительности инкубации и температуре, поскольку количественное определение в этом методе не базируется на точном измерении ферментативной активности. Результаты, согласующиеся с этим предположением, были получены при построении калибровочных кривых для определения теофиллина при различных температурах (рис. 10-18). Как видно из рисунка, расстояние миграции существенно не зависит от температуры в интервале от 4 до 37 "С. В другой серии опытов (данные не представлены) варьировали время последовательной инкубации индикаторных полосок в ферментном реагенте и проявителе. Хотя при увеличении времени инкубации до 30 мин в каждом реагенте результаты количественного определения не изменяются, продолжительная инкубация приводила к получению расплывчатых окрашенных зон и снижению воспроизводимости. Вероятно, это обусловлено совместным влиянием диффузии и испарения растворителя. [c.154]

В данном иммунохимическом методе определения КК-МВ используются как ингибирующие, так и преципитирующие свойства козьей антисыворотки против изофермента КК-ММ (Wi ks et al., 1982). В ходе анализа к образцу тестируемой сыворотки добавляют избыток антител, специфичных к М-субъ-единицам. В результате полностью подавляется ферментативная активность М-субъединиц в составе КК-ММ и КК-МВ. В другой пробирке с использованием тех же антител достигают преципитации изоформ КК-ММ и КК-МВ, содержащихся в образце. Разница в остаточной активности между этими двумя пробирками является количественной мерой активности В-субъ-единицы, входящей в состав гибридного изофермента КК-МВ. Ниже приведено подробное описание данной методики. [c.327]

Введение новых методических приемов каждый раз поднимало биохимическую науку на более высокую ступень познания закономерностей жизнедеятельности организмов, открывало новые уровни исследования живого. Своеобразной чертой последнего периода в развитии биохимии является широкое применение скоростных методов анализа в соединении с автоматическим контролем. Это в значительной мере облегчает и ускоряет выполнение намечаемых научных программ. В настоящее время полностью автоматизированы количественное определение ряда соединений—аминокислот в белковых гидролизатах, MOHO- и дисахаридов в биологических жидкостях (кровь, моча и др.) выяснение первичной структуры пептидов, белков и нуклеиновых кислот проведение исследований по кинетике ферментативного катализа и при серийных определениях энзиматической активности элементарный анализ природных соединений синтез пептидов, олигонуклеотидов и белков [c.5]

Движение к активному центру есть движение конформона. Оно происходит путем конформационного раскрытия некоторой щели в глобуле, характеризуемой определенной микровязкостью. Структурное соответствие фермент — субстрат имеет динамический характер количественной мерой соответствия может служить критическая энергия деформации щели, соответствующей размеру и форме молекулы субстрата. При значении модуля Юнга е Ю эрг/см и длине краев щели 1 нм средняя амплитуда тепловых флуктуаций ширины щели составит 0,07 нм. Согласно этим оценкам скорость проникновения субстрата и образование ФСК составит 10 —10 с . Это не обязательно лимитирующая стадия ферментативного катализа. [c.198]

Механизм действия и строение ферментов. Ф. отличаются от небиологич. катализаторов, как правило, количественно более значительной активностью и в особенности высокой специфичностью действия. Обе эти особенности Ф. связаны с их строением и механизмом действия. Различают два основных типа Ф. а) чисто белковой природы б) белковой природы, но требующие для проявления каталитич. активности соединения с низкомолекулярными органич. веществами специального строения — коферментами (в этом случае белковая часть фермента наз. апоферментом). Иногда активность Ф. обоих этих типов связана с наличием в их составе металлич. или иных ионов — т. паз. и о н-ных кофакторов. Структура основных коферментов и механизм нх химич. превращений в ходе ферментативных реакций изучены (см. Коферменты, а также но наименованию отдельных коферментов). Установлено, что коферменты принимают прямое участие в катализируемых реакциях путем переноса определенных химич. группировок, а также электронов и протонов. Однако в отсутствие белка-апофермен-та они либо совершенно неактивны, либо могут осуществлять отдельные стадии реакции с небольшой скоростью (напр., восстановленные никотинамидиые динуклеотиды и их аналоги, см., напр., кодегидрогеназы, способны с небольшой скоростью восстанавливать нек-рые соединеиия). [c.210]

Основным принципом биологического определения является количественная оценка токсического эффекта, оказываемого на ка-кой-либо биологический объект. По избираемым в качестве моделей объектам биологические методы делятся на две основные группы. К одной из них относятся методы, в которых тормозится или инактивируется та или иная ферментативная система, выделенная из организма. В практике ползгчила распространение оценка степени торможения холинэстеразной активности. [c.13]

Так как ферменты — катализаторы определенных химических реакций, то следует количественно изучать их по влиянию на кинетику соответствующей реакции. Для получения сколько-нибудь ясных и новторимых результатов необходимо пользоваться высокоочищенньши, в частности кристаллическими, препаратами ферментов. Сама по себе ферментативная реакция изучается на чистой системе, состоящей из буфера, субстрата (или субстратов) и фермента. Следует всегда помнить, что подобный модельный эксперимент весьма далек от обстановки, в которой ферменты действуют в клетке. В клетке ферменты часто включены в форменные образования, или в так называемую структуру . Одно время полагали, что, измеряя кинетику реакции в присутствии добавки чистого кристаллизованного фермента, мы выясняем максимальную каталитическую активность, на которую способен данный белок. На самом деле это может быть и неверно. Вполне возможно, что, будучи включен в форменные элементы, фермент усиливает свое действие, так как может произойти благоприятное изменение его вторичной и третичной структуры. [c.155]

Изучение кинетики действия ферментов важно не только с теоретической, но н чисто практической стороны. При выборе единицы активности фермента надо знать наилучшне условия его действия, а также то, как влияют на его активность различные факторы. Подобное предварительное исследование кинетики действия обычно необходимо и для успешного осуществления очистки фермента, так как этот процесс должен количественно контролироваться путем систематических определений активности ферментативного препарата на разных стадиях его очистки. [c.108]

Асимметрические органические реакции оказались весьма полезным методом для изучения механизма реакций, для определения относительной конфигурации молекул, а также нашли применение в препаративном синтезе оптически активных соединений. В настоящее время назрела необходимость в подведении итогов в этой области, в полной сводке литературы. Мы предприняли такую попытку обобщить и критически рассмотреть в данной книге материал по асимметрическому синтезу вплоть до 1969 г. Более старые работы рассматриваются в ней не так подробно, как последние данные в этой области, по следующим причинам. Во-первых, работы опубликованные до 1933 г., подробно рассмотрены в книге П. Ритчи ), а во-вторых, дать оценку, особенно количественную, результатов этих старых работ довольно трудно. Мы поставили себе целью составить такой обзор, который был бы достаточно полным, чтобы он не потребовал дополнений по разным разделам и в то же время мог быть использован в качестве справочника при ознакомлении со старыми работами. Прежде всего необходимо очертить границы рассматриваемой области. Следует отметить, что асимметрические ферментативные реакции, полимеризация и гетерогенно-каталитические реакции нами рассматриваются весьма поверхностно. Это обусловлено прежде всего экономией места, а также тем, что эти вопросы достаточно подробно рассмотрены в специальных монографиях ). Мы старались по возможности критически рассмотреть приведенные в обзоре работы. Читатель может убедиться, что мы зачастую избегали проводить стереохимический анализ переходного состояния в асимметрическом синтезе, носящий в высшей степени надуманный характер. Но это не значит, что мы считаем такой подход бесполезным напротив, мы полагаем, что этот путь обсуждения является наилучшей формой представления материала в докладах и дискус- [c.9]

Смотреть страницы где упоминается термин Ферментативная активность, количественное определение: [c.40] [c.382] [c.156] [c.205] [c.9] [c.230] [c.273] [c.27] [c.248] [c.365] [c.27] [c.5] [c.45] [c.45] [c.219] [c.162] [c.427] [c.147]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология