Гель-электрофоретические прибор

Рекомендуется использовать электрофоретический прибор с охлаждением. По окончании электрофореза область разделения исследуемого образца в агарозном геле вырезают в виде узкой продольной полосы, содержащей белковые фракции (фиг. 33), и помещают ее на пластинку агарозного геля с иммунной сывороткой. [c.155]

Рис. П.5. Пример неравномерного электрического поля в геле из-за негоризонтального расположения электрофоретического прибора, А. ДНК млекопитающих (некоторые треки сильно перегружены). Б. Образцы с бактериальной

Для приготовления агаровых пластинок используют предметные стекла. Предварительно их обезжиривают, тщательно промывают водой и высушивают. Стекла нумеруют, укладывают на строго горизонтальную поверхность и на каждое осторожно наливают пипеткой с широким концом 4 мл агара. Пузырьки воздуха в агаре необходимо вывести пипеткой на края стекла. Когда агар застынет и образуется твердый гель, в нем посередине вырезают лунку (щель) для нанесения исследуемого раствора. Приготовленные пластинки укладывают в электрофоретическую камеру. Агаровое плато соединяют с буферным раствором бумажными мостиками из фильтровальной бумаги. В щель каждой пластинки вводят сыворотку крови, предварительно разведенную буферным раствором. На электрофореграмму наносят около 100—300 мкг белка в объеме 0,01 мл. Прибор подключают к источнику тока. Медленно повышая напряжение, доводят силу тока до 20—25 мА (напряжение 200—300 В). Электрофорез проводят в течение 3—4 ч. [c.93]

Электрофоретическое оборудование обычно работает во влажной атмосфере, причем величины напряжения и силы тока, как правило, превышают безопасные пределы. Неправильное обращение с приборами уже привело к нескольким несчастным случаям со смертельным исходом. Омическое сопротивление человеческого тела, обычно составляющее 10 —10" Ом, существенно зависит от физиологического состояния человека и влажности кожи. Для человека опасен даже ток силой 10 мА, так как при поражении током пострадавший обычно не может сам отсоединиться от проводника. Ток силой более 25 мА вызывает серьезные повреждения в организме —остановку сердца, паралич дыхательных мышц, ожоги и т. д., которые могут привести к смерти. Учитывая, что сопротивление тела 10 Ом, напряжение всего лишь в 100 В способно привести к несчастному случаю в результате уменьшения сопротивления вследствие шока, сопровождающегося потоотделением и (или) повреждением кожи, опасно даже меньшее напряжение. Таким образом, приборы для электрофореза и изоэлектрического фокусирования, являющиеся источниками электрического тока, могут представлять опасность для жизни. Если источники питания стабилизованы, то опасность возрастает, так как напряжение во время разъединения проводов или разрыва проводящих соединений в электрофоретической камере увеличивается. При работе на приборе для дискретного электрофореза в полиакриламидном геле, который обычно снабжен стабилизованным источником питания, риск часто недооценивают. [c.327]

Прибор состоит из металлической коробки, электродных сосудов и приспособлений, необходимых для приготовления геля. Металлическая коробка термостатируется циркулирующей водой и может быть установлена в горизонтальном положении при помощи винтовых ножек (рис. 22). В электродных сосудах находятся электроды, представляющ ие собой протянутую вдоль всего дна платиновую проволоку. В каждом сосуде имеется также входное и выходное отверстия для циркуляции буфера. Стеклянные пластинки предварительно смазывают силиконовым маслом и высушивают в печи. Это делают для того, чтобы после электрофореза высохший агар легко можно было снять со стекла. Затем пластинку прикрепляют к пластмассовой рамке зажимами для резиновых трубок и кладут на металлическую коробку, которую тщательно устанавливают в горизонтальное положение. На пластинку выливают теплый (60°С> раствор агара в электрофоретическом буфере. Поверхность [c.62]

Электрофоретический анализ смеси белков проводят с помощью гель-электрофореза или изоэлектрического фокусирования, чаще всего в полиакриламидном геле с додецилсульфатом в качестве денатурирующего агента или без него. Методика описывается в разд. 9.1. В настоящее время в продаже имеется много прекрасного оборудования начинающим можно посоветовать сразу же приобрести прибор для тонкослойного электрофореза. Пожалуй, сейчас в мире мало найдется биохимических лабораторий, в которых не было бы оборудования для аналитического гель-электрофореза. [c.12]

Схема выглядела бы нелепо, так как буфер из трубки и верхнего резервуара должен был вылиться в нижний. Эту трудность можно обойти, если придать каналу с жидкостью U-образную форму. Такие приборы использовались на первых этапах развития метода (электрофорез в свободной жидкости). Хуже другое в жидкости нельзя избежать конвекции, которая деформирует и смешивает разделяющиеся зоны. Поэтому в современных приборах рабочий канал заполняют гелем, что на схеме изображено штриховкой. Достаточно чистая и хорошо смачиваемая (гидрофильная) пространственная сетка геля удерживает жидкость от вытекания и препятствует конвекции. Вместе с тем используемые гели содержат очень много жидкости (80—99,5%), в которой (т. е. в рабочем буфере) и мигрируют макромолекулы. Наличие сетки геля вносит важную дополнительную деталь в картину электрофоретической миграции. Теперь фракционируемые макромолекулы любых размеров неизбежно сталкиваются с нитями полимера, образующего сетку геля, что увеличивает эффективное трение о среду, а следовательно, снижает скорость движения молекул. Очевидно, что препятствия для миграции становятся особенно серьезными, если средний диаметр пространственных ячеек геля оказывается соизмерим с размерами макромолекул. В этом случае решающее влияние на электрофоретическую подвижность различных макромолекул и степень разделения оказывает соотношение их линейных размеров. Возможна даже такая ситуация, когда особенно крупные молекулы белков или нуклеиновых кислот вообще не смогут протиснуться через поры геля и их миграция прекратится. [c.4]

Для электрического питания электрофоретических приборов обычно применяют различные нестабилизованные источники питания, напряжение в которых выбирается в соответствии с возможностью отвода тепла из прибора. Пульсирующие источники постоянного тока дают такое же хорошее разделение, как и источники обычных типов с КС- или ЬС-выпрямителем. Эти источники наиболее безопасны, так как напряжение в них после выключения питания сразу же падает до нуля. Вследствие более высокого максимального напряжения пульсирующего источника прибор должен быть настроен на необходимое напряжение. Для более точного и безопасного контроля разделений можно использовать источник стабилизованного тока (проточный электрофорез, зональный электрофорез с носителем, гель-электрофо- [c.324]

В то время как обычный электрофорез белков в тонком слое сефадекса, по-видимому, не представляет особого интереса, сочетание тонкослойной гель-фильтрации с последующим электрофорезом существенно расширяет возможности метода, поскольку наряду с более высоким разрешением здесь удается провести электрофоретическую идентификацию разделяемых компонентов. Методика двумерного фракционирования белков была разработана Иоханссоном и Римо [49] и подробно изложена в работе Хансона и сотр. [14]. Согласно этой методике, первой стадией разделения является гель-фильтрация в слое сефадекса (0-200 или 0-100) толщиной 0,5 мм на пластинках размером 30-30 см. Затем в перпендикулярном направлении в течение 3—4 ч ведут электрофорез при градиенте напряжения 10 В/см. В качестве электролита используют 0,05 М вероналовый буфер с pH 8,6. При электрофорезе пластинку необходимо охлаждать. Относительно простой и удобный прибор показан на рис. 5. [c.269]

В электрофоретической ячейке можно заполимеризовать несколько слоев геля с различной степенью пористости и с различными буферными растворами. Таким образом, открываются дополнительные возможности для улучшения разделения полиэлектролитов. Нетрудно, например, создать прибор для наблюдения изоэлектрических спектров или спектров подвижности белков по принципу Колина, описанному выше. В последнее время получил большое распространение так называемый дисковый электрофорез ( disk ele trophoresis ), предложенный Рейсфельдом, Люисом и Уильямсом в 1962 г. [49]. Эти авторы разделяли смесь основных белков в тонкой стеклянной трубочке диаметром всего 5 мм. Эта трубка устанавливалась вертикально и содержала три слоя геля, последовательно заполимеризованных на калий-аце-татном буфере нижний мелкопористый (15% акриламида) и два крупнопористых (3% акриламида). Верхний крупнопористый слой содержал исследуемый белковый раствор. Поверх геля наливался буферный раствор с тем же pH, но с менее подвижным катионом Р-аланином вместо калия. [c.98]

Электрофорез обычно проводят в холодной комнате при силе тока 5 мА на длину геля и напряжении до 100 В до тех пор, пока бромфеноловый синий не приблизится ко дну трубки. После окончания электрофореза верхний резервуар освобождают от буфера, электрофорезные трубки вынимают и со дна их удаляют мембранные пленки. Для прокраски гель (при помощи заполненного водой шприца) выдавливают в пробирку, заполняют ее 10%-ной уксусной кислотой и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Уксусную кислоту затем заменяют 0,2%-ным раствором красителя лазурного А в 0,4 М натрийацетатном буфере ( pH 4,63) и оставл5пот на 1ч при комнатной температуре. Затем избыток красителя удаляют электрофоретически в специальном серийном приборе или же продолжительным (обычно в течение ночи) промыванием водой. После этих операций тРНК становится видна как относительно широкая полоса, довольно далеко отстоящая от старта. Ее легко можно отличить от рибосомной РНК, остающейся на старте или вблизи него, и от фрагментов РНК, образующих менее заметные полосы. [c.231]

Электрофоретическое разделение исследуемых веществ можно также осуществлять на пластинах полиакриламидного геля размерами ЮОХЮО мм при толщине слоя геля от 1 до 3,5 мм. Пластины с углублениями для внесения образцов приготавливают на особых подставках. Для проведения электрофореза требуется специальное оборудование. Конструкция прибора позволяет устанавливать пластины в вертикальное положение при этом канавки для образцов должны быть расположены у верхнего края пластины и контактировать с верхним буфером, тогда как противоположный край пластины должен находиться в контакте с нижним буфером. Необходимо обеспечить циркуляцию охлаждающей жидкости по поверхности пластины с обеих ее сторон. Основное достоинство этой системы заключается в том, что она позволяет проводить одновременное разделение нескольких образцов в одинаковых условиях, благодаря чему их легко можно сравнивать между собой. Считается, что пластины легче анализировать с помощью денситометра, однако для этого необходимо иметь специальный прибор. Кроме того, пластинки можно без особого труда разрезать на полоски и проанализировать их на наличие различных компонентов путем окрашивания или определения радиоактивности. Полоски можно также высушивать и хранить. Однако для приготовления пластин требуется больше акриламида, особенно если анализируется немного образцов. Как и в случае электрофореза в трубках, для данного метода разработан целый ряд однородных и неоднородных ( прерывистых ) буферных систем. Здесь применяются те же способы приготовления гелей, методики разделения и анализа, что и при электрофорезе в трубках. [c.265]

Рис. 9. Прибор для электрофореза в градиенте) плотности в начале электрофоретического разделения [985]. А, Л-образная трубка. Б. Составные части поршня. 1 — аппарат для создания градиента плотности 2 — двухходовой кран 5 —трехходовой кран — пластмассовый шприц для вне сения пробы 5 — пропускание воздуха для перемешивания раствора при формировании градиента 6 — ось редуктора, понижающего число оборотов мотора 7—нитка 8 — анодная платиновая спираль Р —градиент —поршень /7 —проба в выбранном положении /2 — насыщенный раствор сахарозы 75 —пробка из полиакриламидного геля 74 — насыщенный раствор хлористого натрия /5 — катод 75 —водяная рубашка для термостатировання 77—пластмассовая трубка 75 —зубчатая насечка 7Р —пробка из полиакриламида или агарозы 20 — уплотнительное кольцо 21 — наконечник для присоединения пластмассовой трубки.

Самый простой способ обеспечения стабильности электрофоретических зон заключается в том, что в среду для электрофореза вводят вещества, образующие капиллярную структуру. Ан-тиконвекционные свойства такой системы весьма высоки, если площадь поперечного сечения капилляров достаточно мала, так как в канале круглого сечения скорость потока снижается пропорционально четвертой степени радиуса. В качестве поддерживающей среды чаще всего используются фильтровальная бумага, пленки из ацетата целлюлозы, колонки или блоки целлюлозного порошка, гранулированный крахмал или гранулы поливиниловых полимеров, а также агаровый, агарозный, крахмальный или полиакриламидный гели. Зональный электрофорез в поддерживающей среде имеет ряд важных преимуществ. При его проведении можно использовать какой-либо простой и сравнительно недорогой прибор и анализировать одновременно несколько различных препаратов. Процедуры визуализации зон и выделения фракций осуществляются довольно легко. Вещества, обладающие биологической активностью, можно выявить непосредственно на электрофореграммах. Метод легко приспособить как для крупномасштабного разделения веществ, так и для микроразделения. Удается достигнуть очень высокой разрешающей силы, особенно в среде, характеризующейся одновременно антикон векционными свойствами и эффектом молекулярного сита. [c.34]

Непрерывная электрофоретическая элюция. Одним из наиболее важных узлов в приборах для препаративного электрофореза в полиакриламидном геле такого типа является элюционная камера, образующаяся между нижней поверхностью геля и стенками нижней части прибора. При иопользова нии подобных приборов возникают следующие трудности [c.119]

Прерывистая электрофоретическая элюция. Чтобы избавиться от разведения выделяемых фракций, некоторые исследователи предпочапают использовать метод прерывистой элюции [175, 666, 1083, 1128]. В данном случае в ходе опыта электрофорез неоднократно прерывают и элюат каждый раз удаляют. Пай-дак [958] описал очень простой прибор, предназначенный для этой цели (рис. 47). Гель получают в стеклянной трубке длиной 70 мм и диаметром 30 мм, охлаждаемой снаружи электродным буферо м. Через середину геля проходит внутренняя трубка длиной 100 мм и диаметром 5 мм, оканчивающаяся в элюционной камере, ограниченной снизу диализной мембраной. Периодически через эту трубку пипеткой отсасывают буфер, содержащий элюированные белки, а в камеру вновь заливают Схематическое изображение прибо- [c.121]

Нейтрализуют гель 1 М фосфатом натрня (pH 6,5) в течение 30 мин. 2) Электрофоретически переносят ДНК в полусухом приборе для блоттинг-гибридизацин в 25 мМ фосфате натрня (pH 6,5) при 4°С в течение [c.291]

Электрофорез ведут в течение 3—18 ч в зависимости от количества антигена и его электрофоретической подвижности в геле при pH 8,6. Напряженность электрического поля должна составлять 10—20 В/см при обязательном охлаждении столика прибора до 4—10°. Выбор pH буфера продиктован стремлением свести до минимума электрофоретическую миграцию антител, заплавленных в гель агарозы. [c.140]

Выход белков из геля на фильтр можно значительно ускорить, использовав электрофоретическую элюцию белков из пластины геля в поперечном направлении, подобно тому, как это было описано для электрофоретической отмывки красителя [Towbin et al., 1979]. Для этого собирают такую же систему, как в предыдущем варианте, с тем лишь отличием, что нитроцеллю-лозный фильтр ( Millipore НА ) накладывают на гель только с одной стороны — той, куда будут мигрировать белки под действием электрического поля. Весь сэндвич помещают в прибор для электрофоретической отмывки геля и подбирают напряжение так, чтобы напряженность поля в геле составляла около 6 В/см. Если электрофорез белков вели в отсутствие ДДС-Na (например, с мочевиной), то предварительное вымачивание геля и всех компонентов системы, а также саму элюцию можно вести в 0,7 /о-ной уксусной кислоте. За 1 ч белки полностью выходят из геля в направлении катода и прочно сорбируются на нитроцел- [c.107]

В горизонтальном приборе для электрофореза можно вести электрофоретическую элюцию одновременно из нескольких полосок, вырезанных из препаративного геля [Wienand et al., 1979]. На рабочий столик прибора устанавливают пластину 10/о-ного геля агарозы, примерно на 2 мм более толстую, чем исходный гель, в котором проводили фракционирование нуклеиновых кислот. В этой пластине параллельно электродным резервуарам вырезают ряд прямоугольных окон. Ширина окон должна быть примерно вдвое больше, чем ширина полосок элюируемого геля. Диализные мешочки завязывают с двух концов и прорезают вдоль. В окна заливают немного рабочего буфера и укладывают диализные мешочки так, что пленка каждого из них выстилает дно и боковые стороны одного из окон, а разрез в пленке раС полагается сверху. Через эти разрезы в мешочки, заполненные тем же буфером, вносят полоски геля и укладывают их на дно [c.159]

Желание экспериментаторов хоть как-то оградить себя от вредного воздействия радиоактивности повлекло за собой выявление полос ДНК как колориметрическими, так и хемилюминесцентными методами. Однако эффективное проведение таких реакций возможно только с фрагментами ДНК, сорбированными на поверхности какого-нибудь твердого носителя, а не находящимися внутри полиакриламидного геля. Чисто технические трудности переноса фрагментов ДНК из секвенирующего полиакриламидного геля на нейлоновые, нитроцеллюлозные или какие-то другие мембранные фильтры заметно сдерживали развитие этого подхода. Разработка специальных приборов для секвенирующего электрофореза с одновременным переносом выходящих фрагментов ДНК из нижнего среза геля на находящийся в соприкосновении с ним движущийся мембранный фильтр заметно упростила процедуру переноса (более подробно такие приборы вместе с особенностями переноса фрагментов ДНК, а также другие способы переноса рассмотрены в главе, посвященной электрофоретическому разделению секвенируемых фрагментов ДНК). [c.105]

Другой крайностью является использование миниатюрного ультра-тонкого (50 мкм) геля, заливаемого между предметными стеклами для микроскопа, размерами 25 х 75 мм [Stein et al., 1998], Электрофоретической камерой для такого геля служил обычный прибор для горизонтального агарозного электрофореза, время разделения в котором составляло около 6-7 мин. Несмотря на столь малые размеры геля авторам цитируемой работы при использовании в качестве метки радионуклида 35 удалось прочитать с рентгеновской пленки после 16-часовой экспозиции более 150 нуклеотидов. [c.171]

Стекла довольно маленького размера (обычно 14 см, но с возможным варьированием от 6 см до 20 см) для секвенирующего гель-электрофореза использовались со специальным прибором, рассчитанным на прямое электрофоретическое блоттирование [Веек, Pohl, 1984], Принцип метода заключается в постоянном движении специальной нейлоновой мембраны и ее тесном контакте с нижним срезом геля. Таким образом, фрагмент ДНК, выходя из геля, переносится на данную мембрану и сорбируется в определенном месте. Поскольку используемая длина геля оказывается достаточной для разделения одного фрагмента ДНК, отличающегося на один нуклеотид, от другого, то отпадает надобность в стеклах большого размера, требующих значительно большего времени до выхода образца из геля. После экспозиции данной мембраны с сорбированными на ней фрагментами ДНК на рентгеновскую пленку удается прочитать 500-600 и даже около 1000 нуклеотидов. [c.171]

Первые успехи в автоматизации секвенирования ДНК, пожалуй, можно связать с полуавтоматическими и автоматическими методами. чтения последовательности нуклеотидов с радиоавтографа секвенирующего геля или даже еще с более ранней автоматической обработкой и анализом последовательности нуклеотидов с помощью компьютеров и специализированных программ. Однако в настоящее время под автоматическим секвенированием ДНК понимается, в первую очередь, электрофоретическое разделение флуоресцентно меченных продуктов терминирующих реакций с помощью специальных приборов - автоматических секвенаторов ДНК. Другой аспект автоматизации процесса секвенирования ДНК заключается в наработке матриц для их последующего ферментативного секвенирования, а также проведении секвенирующих реакций (как в ферментативном методе, так и в методе химической деградации) с помощью лабораторных биороботов. [c.309]

Для мечения вновь синтезируемых цепей ДНК в условиях терминации при автоматическом секвенировании используют молекулу какого-либо флуоресцирующего соединения. К подобным соединениям предъявляется ряд требований. Во-первых, они должны иметь высокий квантовый выход при флуоресценции, обеспечивающий в приборах разного типа детекцию очень малых количеств ДНК. Во-вторых, у флуорофоров, используемых для мечения разных азотистых оснований с их последующей детекцией в одной дорожке секвени-рующего геля или в одном капилляре, должны быть неперекрывающиеся или незначительно перекрывающиеся спектры эмиссии. В-третьих, желательно, чтобы флуоресцентные красители, используемые для разных нуклеотидов, не различались существенно по своему влиянию на электрофоретическую подвижность меченных ими фрагментов ДНК. [c.42]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология