Бактерии экспрессия генов животных

В отличие от бактерий в клетках эукариот внехромосомные, автономно реплицирующиеся генетические элементы типа бактериальных плазмид встречаются редко. Поэтому при конструировании векторов, способных реплицироваться и осуществлять экспрессию в клетках животных, чаще всего используют регуляторные генетические элементы вирусов животных или, в зависимости от задач, эукариотических генов домашнего хозяйства, а также генов, для которых характерна тканеспецифическая экспрессия. [c.133]

Только на первый взгляд экспрессия рекомбинантных генов в бактериальных и дрожжевых клетках под контролем хорошо изученных регуляторных элементов представляется простой задачей. На практике, как уже обсуждалось ранее, экспрессия эукариотических генов в бактериях происходит неэффективно из-за образования нерастворимых телец включения и отсутствия необходимых посттрансляционных модификаций рекомбинантных полипептидных цепей. Для преодоления этих и некоторых других затруднений в последнее время широко используются культивируемые клетки животных и растений. [c.174]

ВекторыpGEM. Описанные плазмидные векторы пригодны лишь для клонирования генов в клетках Е. соН и родственных им грамотрицательных бактерий, например. Salmonella и Serratia. Они универсальны — их используют для самых разнообразных целей. В то же время сконструировано много специальных векторов, приспособленных, например, только для идентификации регуляторных сигналов, для суперпродукции чужеродных белков и их секреции, для секвенирования ДНК, экспрессии генов животных в [c.201]

Среди П, обеспечивающих устойчивость бактерий к антибиотикам, осн массу составляют т наз факторы множеств резистентности, несущие сразу неск соответствующих детерминант С помощью трансмиссибетьных П детерминанты резистентности легко могут распространяться между видами, способными к конъюгации На такие П гены резистентности могут передаваться с помощью транспозонов Кроме детерминант лек резистентности из числа функцион элементов П хорошо изучены гены нек-рых бактериальных токсинов, напр энтеротоксинов, вырабатываемых возбудителями кишечных инфекций, носителями т наз Тох-П (факторов патогенности энтеробактерий) Показана способность Тох-П передаваться между бактериями в организме животных и человека На этих П могут находиться также детерминанты резистентности к антибиотикам В этой связи активно развивается новое направление в практич бактериологии-поиск и создание в-в, избирательно подавляющих репликацию плазмид или экспрессию их генов Пример таких в-в-клавулановая к-та (ф-ла I) и ее производные - ингибиторы Р-лактамазы [c.553]

С помощью бактерий были получены с высоким выходом некоторые белки — продукты генов животных и-их вирусов. Так,,, были созданы штаммы Е. соИ, у которых 20% всего- клеточного белка составляли коровый антиген вируса гепатита В, гор -МОН роста человека или главный капсидный антиген вируса ящура. У одного из сконструированных штаммов В. suhtblis-последний составлял около 1% синтезируемого этой бактерией белка. Однако добиться экспрессии в бактериальных клетках генов некоторых белков животных или их вирусов совсем непросто, даже если эти гены сопряжены с сигналами инициации транскрипции и трансляции, которые обеспечивают в норме-высокий уровень экспрессии генов прокариот. Причины такой. неэффективной экспрессии не всегда ясны, но в некоторых случаях удалось установить, что протеазы бактерий быстро разрушают белки животных и вирусов. В подобных ситуациях можно повысить выход, применяя несодержащие протеаз мутанты.. При выработке проинсулина, предшественника инсулина, неко торая защита от протеаз обеспечивается тем, что полипептид, секретируется в периплазматическое пространство у клеточной стенки Е. oll. На N-конце молекулы препроинсулина находится последовательность гидрофобных аминокислот, с помощью которой (с одновременным ее отщеплением) осуществляется транспорт этой молекулы через мембрану в периплазм [c.319]

Конъюгативный перенос бактериальных генов в клетки животных. Перенос генов во время конъюгации бактериальных клеток, когда мужские и женские клетки вступают в контакт друг с другом через объединяющий их цитоплазматический мостик, является широко распространенным и хорошо изученным генетическим явлением [224, 225]. Недавно была продемонстрирована возможность конъюгативного переноса ДНК из бактериальных клеток в культивируемые клетки животных [226]. В этой серии экспериментов В.Л. Ватерсу удалось показать, что гены устойчивости к антибиотикам, находящиеся в составе конъюгатив-ной плазмиды Е. соН, переносятся с низкой частотой в клетки яичников китайских хомячков СНО К1 из бактериальных клеток, давая возможность клеткам-реципиентам выживать на селективной среде в присутствии соответствующих антибиотиков. При этом не происходило поглощения бактериальных клеток клетками животных посредством эндоцитоза, и перенос имел место в присутствии ДНКазы в питательной среде, что исключало непосредственный захват ДНК клетками из культуральной жидкости. Чужеродная ДНК реплицировалась в клетках животных, а экспрессия генов генетических маркеров происходила лишь в том случае, если гены находились под контролем эукариотических промоторов. Хотя конъюгативный перенос генов бактерий в клетки дрожжей, а также растений (Ti-плазмиды) известен давно, обсуждаемая работа впервые продемонстрировала возможность непосредственного обмена генами между бактериями и клетками высших животных. В том случае, если данный процесс удастся оптимизировать, у генной инженерии появится дополнительная возможность введения очень больших молекул ДНК в клетки животных, в том числе и в целях генотерапии. [c.154]

Однако не всегда при успешной экспрессии чужеродного гена можно получить функционально активный продукт. Дело в том, что многие эукариотические белки активируются только после их модификации (например, после протеолиза, гликозилирования, фосфорилирования и т. п.), происходящей в результате действия специфических клеточных ферментов. Но чужеродные белки могут неправильно модифицироваться или не модифицироваться вообще. Это ограничивает выбор реципиентных клеток, когда нужно получить активные модифицированные белки. В таких случаях для клонирования генов приходится использовать клетки орга низмов, родственных тем, откуда были взяты гены. С этой целью разрабатываются системы клонирования и экспрессии генов в различных семействах бактерий и низших грибов, в растительных и животных клетках ( Транскрипция и трансляция. Методы , 1987 Maximizing gene expression , 1986). [c.314]

Подобные копии применяются для экспрессии в бактериях важных с медицинской точки зрения белков человека и животных, таких, как инсулин, ренин, гормон роста и др. В данном случае фрагменты генома нельзя использовать. Это связано с тем, что у эукариот отдельные части некоторых структурных генов разобщены кодирующие последовательности (экзоны) чередуются с некодирующими вставочными последовательностями (нитроны). Ген целиком транскрибируется с обра.зованием первичного транскрипта РНК, затем транскрипты нитронов выщепляются, а последовательности соответствующие экзонам, сши- [c.136]

Все основные принципы, используемые при конструировании бактериальных векторов, применимы и для получения векторов эукариотических клеток. Как и в случае бактерий, эукариотический вектор представляет собой небольшую молекулу ДНК, способную автономно реплицироваться в клетках животных или растений. Помимо последовательностей нуклеотидов, обеспечи-ваюпдих репликацию, эукариотические векторы могут содержать гены, используемые в качестве селектируемых маркеров, а также один или несколько уникальных сайтов рестрикции, по которым производится встраивание клонируемых последовательностей нуклеотидов ДНК. Поскольку непосредственное клонирование рекомбинантных ДНК в клетках животных или растений было бы дорогостоящей и малоэффективной процедурой, эукариотические векторы используют, как правило, для получения экспрессии уже клонированных последовательностей нуклеотидов в клетках высших эукариот, а сам процесс клонирования проводят в бактериях. Следовательно, эукариотические векторы, помимо всего прочего, должны быть челночными векторами. Для экспрессии в клетках рекомбинантные ДНК помещают под контроль регуляторных элементов, узнаваемых и используемых ферментативными системами эукариотических клеток. [c.133]

Для медрщинских целей растения используют тысячи лет, но генетическая ршженерия позволила создать новые растения, белковые продукты которых важны для терапии различных заболеваний. Гены терапевтически важных белков человека и животных можно вводить в разные системы экспрессии, каждая из которых имеет свои достоинства и недостатки. Идеальной является система экспрессии, которая наиболее безопасна и обеспечивает продукцию биологически активного продукта по минимальной цене. В системе клеток млекопитающих могзт синтезироваться белки человека и животных, в максимальной степени схожие с природными, но культивирование таких клеток дорого и ограничено по масштабу Бактерии можно производить в большом масштабе, но синтезируемые в них эукариотические белки далеко не всегда имеют правильную третичную структуру. Кроме того, они не могут подвергаться посттрансляционной модификации. [c.468]