Сплайсинг-векторы

Рис. 20.29. Продолжение) Б. В полилипкер вектора для улавливания экзонов встроен фрагмент ДНК человека, и эта конструкция введена в эукариотическую клетку (трансфекция). В данном случае экзон содержит функциональные акцепторный и донорный сайты сплайсинга. При процессинге первичного транскрипта удаляются интроны, фланкирующие экзон А, и он оказывается между экзонами 1 и 2. Длина ПЦР-продукта обратного транскрипта показывает, пойман ли искомый экзон между экзонами 1 и 2 и, следовательно, содержит ли его данная вставка.

I. Сплайсинг-векторы. Наиболее естественным подходом в конструировании векторов для спаренных генов может считаться имитация механизма, свойственного родительским ретро-вирусам, а именно использование вирусных донорных и акцеп- [c.281]

Одна из общих неприятностей, связанная с использованием сплайсинг-векторов подобного типа, обусловлена тем, что эффективность вирусного сплайсинга может резко изменяться, что приводит к снижению уровня экспрессии одного из генов клонированной пары. Эта проблема обсуждается ниже в разд. 9.7, [c.282]

В экспрессирующие векторы млекопитающих уже встроены гены самых разных белков и осуществлена их экспрессия в хозяйских клетках. Иногда выход продукта увеличивался, если между промотором и клонированным геном встраивали интрон. Механизм этого феномена неизвестен. Возможно, первичный транскрипт клонированного гена содержит скрытые сайты сплайсинга, по которым вырезается часть кодирующей области клонированного гена, а при наличии дополнительного интрона сплайсинг по ним происходит с меньщей вероятностью. [c.150]

Если в вектор встроить рестрикционный фрагмент, содержащий некий экзон А и фланкирующие его интроны, то после трансфекции процессированный транскрипт будет содержать три экзона экзон 1-экзон А-экзон 2. Длина ПЦР-продукта будет больше, чем в тех случаях, когда в векторе нет вставки, когда вставка содержит экзон без функциональных сайтов сплайсинга (донорного и акцепторного) или когда вставка вообще не содержит экзона. Если во вставке присутствует более одного экзона, каждый из которых имеет функциональные сайты сплайсинга, то процессированный транскрипт будет содержать все эти экзоны. [c.476]

Обучающая выборка была составлена из 155 5 сигнальных последовательностей сплайсинга генов млекопитающих (1 =155) и 1596 фрагментов гена бета-глобина, не являющихся 5 сайтами сплайсинга (1 =1596). В качестве признаков были выбраны девять нуклеотидов три на 3 конце экзона и шесть на 5 конце интрона. Таким образом, количество признаков п=9, а число значений каждого признака одинаково и равно 4. Размерность бинарного пространства признаков и соответственно число неизвестных координат разделяющего вектора N=36. [c.137]

Векторы для спаренных генов с внутренним промотором. Описанные выше сплайсинг-векторы предполагают экспрессик> обоих клонированных генов под контролем промотора, локализованного в пределах 5 -LTR. Альтернативный подход предусматривает использование дополнительного промотора, введенного в вектор таким образом, чтобы обеспечить экспрессию дистального (относительно 5 -LTR) гена, тогда как проксимальный ген по-прежнему экспрессируется при участии вирусного LTR иными словами, каждый ген имеет свой собственный независимый промотор. Как и в случае сплайсинг-векторов один из клонированных генов здесь также выполняет функцию селективного маркера (например, neo). [c.282]

Векторы с внутренним промотором лишены тех недостатков сплайсинг-векторов, которые связаны с вероятностью неадекватного сплайсинга (разд. 9.7). Однако ретровирусы дикого типа не содержат внутренних промоторов, поэтому данные векторы могут давать неудовлетворительную экспрессию клонированных генов вследствие неблагоприятного взаимодействия промоторов (даже однонаправленных) [23, 24]. Как бы то ни было на практике векторы с внутренним промотором хорошо себя зарекомендовали во многих случаях и приобретают все большую популярность. [c.283]

Одной ИЗ ВОЗМОЖНЫХ причин делеций в ретровирусных геномах служит аномальный сплайсинг вирусной РНК. Хотя в MLV-векторах сигнал для упаковки расположен ниже вирусного донорного сайта сплайсинга (относительно направления транскрипции), так что молекулы, претерпевшие сплайсинг с участием именно этого сайта, неспособны упаковываться в вирусные частицы, криптические сайты сплайсинга, присутствуюш,ие во вставке, способны вызывать нежелательные последствия. Делеции и перестройки могут происходить также в результате рекомбинационных событий с участием эндогенных мышиных ретровирусных последовательностей, рекомбинации в процессе трансфекции или же ошибок при обратной- транскрипции и интеграции [14]. Кроме всего прочего в некоторых случаях делеции могут неумышленно отбираться при селекции на экспрессию определенного маркерного гена. Примером этого может служить эксперимент (табл. 9.7), демонстрирующий особенности сплайсинг-вектора для спаренных генов рМХ 1122/иг/с. пео в присутствии последовательности с-тус ингибируется сплайсинг вирусной РНК (разд. 9.7.1). Несмотря на низкую эффективность трансфекции, обнаруживаемую, этим вектором при селекции на устойчивость к G418, трансфицированные клетки активно продуцировали пео-трансдуцирующий вирус (табл. 9.7). Однако последующий анализ показал, что эти вирусные частицы несут делецию с-тус (М. Скотт, Г. Вармус, неопубликованные данные). Следовательно, селекция на эффективную экспрессию гена neo привела к утрате последовательностей с-тус, ответственных за ингибирование образования субгеномной лео-мРНК- Высокая частота делеций, обусловливающая повышенный уровень экспрессии селективного маркера, также свойственна и векторам с внутренним промотором, однако пока такие данные получены только для векторов на основе ретровирусов птиц [41]. [c.305]

Описанный в гл. 19 метод клонирования чужеродных последовате ьностей в бактериофагах или плазмидах может быть использован и для встраивания генов в эукариотические вирусы. Путем внесения необходимых разрывов рестриктазами и последующего объединения полученных фрагментов глобиновый, инсулиновый и другие гены из множества источников были встроены в эукариотические вирусные векторы. Один из наиболее распространенных векторов-обезьяний вирус 8У-40, который может размножаться в клетках ряда млекопитающих. Новые гены могут быть встроены в область ранних или поздних генов транскрипционной единицы вируса. Их экспрессия включает стадию образования РНК-предше-ственника, на 5 -конце которого обычно имеются вирусные последовательности, за которыми следует последовательность встроенного гена. Такие РНК подвергаются нормальному сплайсингу, как показано на рис. 26.8. [c.325]

Рис. 26.8. Последовательности вектора 8У-40, в единицах транскрипции которых на месте поздних генов находятся прерывистые гены другого организма, транскрибируются, подвергаются нормальному сплайсингу, и конечные продукты экспор-

Поскольку геномная РНК ретровирусов претерпеэает сплайсинг, интронные последовательности, введенные в сойтав ретровирусного вектора, могут точно выщепляться из вирусного генома. Следовательно, путем клонирования провирусной ДНК после инфицирования с помощью ретровирусных векторов можно получать полноразмерные кДНК-копии генов среднего размера [И, 12]. [c.274]

Векторы, несущие ген dhfr, имеют то преимущество, что провирусные последовательности можно подвергнуть амплификации путем метотрексатной селекции это позволяет повысить уровень экспрессии и титр вирусных препаратов [21]. Тем пе менее наибольшее распространение в качестве доминантных маркеров получили гены, обеспечивающие селективную лекарственную устойчивость — такие, как neo или hgr. Это объясняется тем, что они хорошо сочетаются со многими клеточными типами и не требуют специальной среды для селекции. Во всех известных конструкциях векторов для спаренных генов ген, расположенный ближе к 5 -LTR, экспрессируется в составе геномного вирусного РНК-транскрипта. Для обеспечения экспрессии более удаленного гена применяют два разных методических приема это либо экспрессия в составе отдельной субгеномной РНК, образующейся в результате сплайсинга вирусной РНК, либо использование внутреннего промотора, введенного в состав вектора. [c.281]

Учитывая возможные осложнния, связанные со сплайсингом, кДНК-вставки (если они доступны) предпочтительны по сравнению с последовательностями, содержащими интроны. Хотя ретровирусные векторы обладают способностью точно удалять интроны из геномных последовательностей и таким образом генерировать кДНК-копии клонированных генов, этот процеса не всегда достаточно эффективен [14]. [c.287]

Векторы для спаренных генов с внутреннйм промотором не эксплуатируют вирусную систему сплайсинга. Однако нередко и они не могут обеспечить эквивалентную экспрессию обоих генов. Кроме тех случаев, когда LTR или внутренний промотор оказываются неспособными эффективно функционировать в инфицируемых клетках конкретного типа, экспрессия любого маркера может подавляться также вследствие неблагоприятного взаимодействия двух промоторов. Эмерман и Темин [23], работая с вектором, содержащим внутренний промотор, обнаружили, что селекция, направленная на экспрессию 5 -гена, вызывает эпигенетическую супрессию З -промотора и наоборот. Хотя Э шт эффект, зависящий от специфического сочетания используемых промоторов, по-видимому, наиболее ярко проявляется в векторах, основанных на ретровирусах птиц, он также свойствен я векторам, принадлежащим к семейству MLV [24]. [c.304]

Оптимизация разделения. Наглядным и привлекательным методом оптимизации разделения объектов воспользовался Иида для распознавания 5 сигналов сплайсинга (Ис1а, 1987). Метод не требует полного разделения множеств X и У, допуская небольшое перекрытие распределений и у . Чтобы найти разделяющий вектор f, запишем несложные статистические соотношения. [c.136]

Этот подход избавляет нас от необходимости выделять специфический мутант, поскольку он подразумевает использование бактериальных генов, которые дают селективные преимущества при их экспрессии в клетках млекопитающих [28]. Для этого конструируют плазмидные и ретровирусные векторы, в которых бактериальные гены сочетаются с промоторами, местами сплайсинга и сигналами полиаденилирования млекопитающих. Введение бактериальных генов в клетки млекопитающих с по--мощью трансфекции или инфекции приводит к их случайному распределению в геноме реципиента. В качестве примера бактериальных генов, способных обеспечивать селективные преимущества клеток млекопитающих, можно назвать ген Е. oli gpt (он позволяет клеткам-реципиентам утилизировать ксантин в качестве предшественника для биосинтеза пуринов) и генлео (он обусловливает устойчивость клеток млекопитающих к антибиотику G418) [29]. Основной недостаток этого метода — случайное распределение сайтов интеграции однако последние исследования позволяют надеяться, что с помощью гомологичной рекомбинации удастся осуществлять направленную интеграцию. [c.12]

Регуляторные части генов, а также продукты их экспрессии, мРНК и белки, распознаются соответствующими ферментными системами организма и обеспечивают упорядоченную экспрессию структурной части гена. При этом регуляторные участки генов и промежуточных продуктов их экспрессии, как правило, высокоспецифичны в отношении своих природных генетических эффекторов (РНК-полимераз, рибосом, факторов транскрипции и трансляции, белковых факторов сплайсинга, ферментов, осуществляющих посттрансляционные модификации полипептидов, и т.п.), и чаще всего они не могут эффективно функционировать в гетерологичном генетическом окружении. Очевидно, что при конструировании высокоэффективных экспрессирующих векторов необходимо, прежде всего, учитывать особенности структуры регуляторной части рекомбинантного гена, исходя из того, в каких генетических условиях клонированный ген будет экспрессироваться. Однако не только регуляторные последовательности генов являются препятствием для высокоэффективной экспрессии чужеродных рекомбинантных генов. Как уже было отмечено, структурные части генов про- и эукариот фундаментально отличаются друг от друга по наличию у последних внутри генов интронов. Следовательно, гены эукариот не могут эффективно экспрессироваться в бактериальных клетках, поскольку у прокариот отсутствуют соответствующие системы сплайсинга. Кроме того, у предшественников эукариотических мРНК не может осуществиться в бактериальных клетках и правильный процессинг 3 - и 5 -концевых некодирующих последовательностей. Даже такой [c.106]

Мутационная замена Asn Ala в С-концевой части интеина блокирует последнюю стадию сплайсинга рекомбинантного белка (см. рис. 39), при конструировании которого нуклеотидная последовательность целевого белка 1 была объединена в коммерческом экспрессирующем векторе в одной рамке считывания с последовательностями нуклеотидов мутантного интеина и хитин-связыва-ющего домена ( BD) бактериальной хитиназы. Последний в рекомбинантном белке выполняет роль лиганда, взаимодействующего с иммобилизованным рецептором (хитином), что необходимо для очистки белка с помощью аффинной хроматографии после связывания хроматографическим носителем целевой белок вырезается из полипептида с помощью добавленного тиола (R-HS) в реакции межмолекулярной трансэтерификации, и образовавшееся производное может быть далее лигировано с пептидом, содержащим остаток a- ys. Таким образом, процесс EPL объединяет в себе две стадии тиолиз с участием интеина и спонтанное химическое лигирование нативных белков [c.314]

Рис. 13.4. Строение челночного ретровирусного вектора, gag Тройной линией вь 5елена провирусная ДНК. Стрелками покачаны геномный а) и субгеномный (б. сплайсинг по S -сайтам)

В модели, представленной на рис. 10.45, отсутствует ряд важных деталей, так что для разных этапов процесса можно предложить несколько конкретных механизмов. Например, синтез второй цепи кДНК может происходить до встраивания в новый геномный локус или к ДНК в месте разрыва может присоединиться сама РНК и затем синтезироваться кДНК in situ. Все эти модели весьма привлекательны, и в их поддержку появляются все новые данные правда, можно построить и другие модели, удовлетворяющие большинству этих данных. Итак, распределение каких-то последовательностей по всему геному может проходить по-разному. Высказывалось предположение, что природными рекомбинантными векторами являются ретровирусы. Ретровирусные геномы действительно внедряются в клеточные гены и по прошествии одного или нескольких клеточных циклов могут покидать эти гены, встраиваясь в новые локусы. За время жизненного цикла ретровируса его геном поочередно бывает представлен то ДНК, то РНК. При этом из РНК во время сплайсинга могут удаляться интроны, в результате чего на стадии ДНК образуются процессированные гены. Эта модель объясняет наличие необычных последовательностей в процессированных генах с 5 -стороны от сайта инициации транскрипции, а также отсутствие А-богатого З -конца. Из нее, в частности, следует, что некоторые процессированные гены должны соседствовать [c.268]

ААТААА (разд. 8.3). В ходе работы с этими вирусами были открыты интроны и сплайсинг (разд. 8.5), а также белки, регулирующие транскрипцию, например Spl (разд. 8.3). И до сих пор эти вирусы остаются весьма ценной модельной системой при изучении новых аспектов молекулярной генетики эукариот и используются для конструирования эукариотических векторов. Например, исследуются механизмы репликации вирусных геномов созданы системы, в которых такая репликация осуществляется in vitro. Эти, а также другие ДНК-содержащие вирусы могут служить моделями для изучеиия дифференцировки и развигия сложных организмов, поскольку их жизненный цикл состоит из упорядоченных во времени событий, а кроме того, для них характерны альтернативные способы поведения. Например, вирус SV40 размножается в определенных клетках приматов, но в клетках грызунов он не реплицируется. Вместо этого его геном встраивается в клеточную ДНК, вызывая злокачественное перерождение (рис. 1V.4). [c.346]

С помощью литических векторов замещения поздних генов вируса 8У40 в клетках животных изучена экспрессия ряда других эукариотических хромосомных и вирусных генов, а также ДНК-копий некоторых матричных РНК. Доказано, что в различных клетках млекопитающих механизмы инициации транскрипции генов, сплайсинга и полиаденилирования мРНК, трансляции и секреции белков во многом схожи. Кроме того, обнаружено, что синтезируемые в клетках животных чужеродные белки могут подвергаться гликозилированию. К недостаткам данных литических векторов необходимо отнести прежде всего то, что активная экспрессия клонированных генов происходит лишь на позднем этапе цикла развития гибрид- [c.361]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология