Клонирование генов тотальное шот-ган

Для создания банка генов осуществляют тотальное клонирование , используя для встраивания в вектор смесь фрагментов ДНК, [c.268]

Чтобы выделить геномный клон р53, использовали библиотеки клонированных фрагментов тотальной ДНК мыши или человека. ДНК фрагментировали рестриктазами и встраивали в бактериофаг X, которым затем заражали бактерии. Образовывалось множество бляшек. С ними гибридизовали ДНК ранее полученных клонов и таким образом находили колонии фагов, содержащие ген р53. В результате были изолированы полные геномные копии гена р53 мыши и человека. Сравнение между собою геномных и кДНК клонов позволяет выяснить экзон-интронную структуру гена. Такая работа была проделана почти одновременно в ряде лабораторий, в том числе в нашей [c.43]

Для идентификации бактерий иногда используют также метод ДНК-зондов (генных зондов), являющийся разновидностью метода молекулярной гибридизации ДНК—ДНК. Реакция гибридизации ведется в этом случае не между двумя препаратами тотальной ДНК, а между фрагментом нуклеотидной последовательности ДНК (зондом), включающим ген (генетический маркер), ответственный за какую-то определенную функцию (например, устойчивость к какому-нибудь антибиотику), и ДНК изучаемой бактерии. Самым распространенным способом создания генных зондов является выделение специфических фрагментов путем молекулярного клонирования. Для этого вначале создают банк генов изучаемой бактерии расщеплением ее ДНК эндонуклеазами рестрикции, а затем отбирают нужный клон из суммы фрагментов ДНК методом электрофореза с последующей проверкой генетических свойств этих фрагментов методом трансформации. Далее выбранный фрагмент ДНК с помощью фермента лигазы вводят в состав подходящей плазмиды (вектора), а эту комбинированную-плазмиду вводят в удобный для работы штамм бактерий (например, Es heri hia соН). Из биомассы бактерии, несущей ДНК-зонд, выделяют плазмидную ДНК и метят ее, например, радиоизотопной меткой. Затем осуществляют гибридизацию ДНК зонда с ДНК бактерии. Образовавшиеся гибридные участки проявляют методом ауторадиографии. По относительной частоте гибридизации генетического маркера с хромосомой той или иной бактерии делают заключение о генетическом родстве этих бактерий с исследуемым штаммом. [c.197]

Для получения полной или частичной геномной библиотеки проводят тотальное (валовое) клонирование всех выделенньгх фрагментов ДНК. Такой способ клонирования называют также щот-ган (shot-gun)-экспериментом. В случае же конструирования рекДНК, содержащей определенный ген с некоторыми известными характеристиками, фрагменты ДНК, получаемые под действием рестриктаз, разделяют с помощью электрофореза в агарозном или полиакриламидном гелях. Если размер фрагмента, несущего нужный ген, неизвестен, его находят методом гибридизации по Саузерну (см. приложение). Для этого разделенные фрагменты ДНК переносят из геля на нитроцеллюлозный фильтр, гибридизуют с радиоактивным РНК- или ДНК-зондом к нужному гену и подвергают авторадиографии. След на рентгеновской пленке указывает на положение искомого фрагмета ДНК в геле. Этот фрагмент [c.241]

Отсутствие заметной гомологии между ДНК многих микоплазм было отмечено еще в работах конца 60-х годов [58—60]. По более точным количественным данным перекрестной гибридизации ДНК разных микоплазм в растворах было установлено, что гомология по ДНК у большинства видов не превышает 2 %, и только у нескольких пар сравниваемых микоплазм гомология составила от 4 до 21 % [61—63]. В нашей работе [64] по перекрестной блот-гибридизации ДНК ряда микоплазм показано, что при низком уровне гомологии ДНК исследованных видов эта гомология касается отдельных протя- женных фрагментов генома, а не коротких участков, распределенных по всей его длине. Более того, у некоторых микоплазм единственными гомологичными участками ДНК оказываются рибосомные гены., На основании этих результатов мы начали использовать в качестве гибридизационных зондов для обнаружения и идентификации микоплазм тотальные препараты ДНК, полученные из микоплазм, выращенных на специальных средах. Такие зонды оказались высокоэффективными и достаточно специфичными, но их нельзя рекомендовать к широкому применению, так как получение чистых культур микоплазм и их выращивание в препаративных количествах связаны со значительными техническими трудностями. В связи с этим мы предприняли клонирование случайных рестриктазных фрагментов ДНК микоплазм в бактериальной плазмиде pBR322 и проверку рекомбинантных Ь лазмиЯ на специфичность в опытах по блот- и дот-гибридизации с ДНК различных микоплазм и ДНК клеток эукариот. Был составлен комплект плазмид-зондов, содержащих фрагменты ДНК, видоспецифичные для каждой из взятых микоплазм. В дальнейшем этот комплект должен быть расширен. [c.118]

Открытие возможности избирательной амплификации определенных участков ДНК с помощью полимеразной цепной реакции [Saiki et al., 1985, 1988] оказало чрезвычайно сильное влияние на всю молекулярную биологию, включая и секвенирование ДНК. До появления этого метода можно было секвенировать только рекомбинантные молекулы ДНК (кроме некоторых частных случаев). Причина этого кроется в низком содержании в геноме какой-либо определенной, даже повторяющейся, последовательности и невозможности детекции столь малого количества фрагментов ДНК при их секвенировании. Теоретически можно было бы детектировать на радиоавтографе секвенирующего геля полосы ДНК какого-нибудь условного гена, если взять в реакцию около 500 мг тотальной ДНК с ее концентрацией в реакционной смеси приблизительно 50 г/мл. Поскольку такое принципиально невозможно, то для определения последовательности нуклеотидов было необходимо использовать ДНК, обогащенную каким-либо геном или просто определенным участком, что и достигалось ранее посредством клонирования. В связи с достаточной сложностью методов клонирования получение таких рекомбинантных ДНК и их последующее секвенирование было доступно далеко не всем не молекулярно-биологическим лабораториям. Амплификация же определенных фрагментов ДНК с помощью специфических праймеров, приводящая за короткий промежуток времени к наработке значительных количеств нужных участков ДНК, явилась мощной и доступной альтернативой методу клонирования. Таким образом, многие лаборатории, ранее и не помышлявшие о секвенировании ДНК ввиду сложности подготовительных этапов, стали активно использовать этот метод в своих исследованиях. Поэтому можно смело предположить, что удельный вес ПЦР-секвенирования в общем определении нуклеотидных последовательностей различных ДНК будет несомненно возрастать. Что касается тех, кто и так раньше владел методами секвенирования ДНК, то они также взяли на вооружение метод ПЦР-секвениро-вания и занялись разработкой его различных модификаций, рассмотрению которых и будет посвящена данная глава. [c.134]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология