Трансформированные клетки, устойчивые

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием плазмидной ДНК Основной недостаток олигонуклеотид-направ-ленного мутагенеза с использованием фага М13 -большое число процедур. Чтобы выделить мутантную форму нужного гена, приходится затратить много времени. В качестве альтернативы системе с использованием фага М13 было разработано множество других подходов, основанных на применении плазмидных ДНК. Это позволяет обойтись без переноса Интересующего исследователя гена из плазмиды в фаговую ДНК, а после завершения мутагенеза - обратно в плазмиду. Один из этих подходов включает встраивание ДНК в плазмидный вектор, который несет функциональный ген устойчивости к тетрациклину и неактивный ген устойчивости к ампициллину в середине последнего заменен один нуклеотид (рис. 8.3). Клетки Е. соИ трансформируют вектором, несущим ДНК-мишень, и двухцепочечную плазмидную ДНК денатурируют щелочью с тем, чтобы получить одноцепочечные кольцевые молекулы. Денатурированную ДНК отжигают с тремя разными олигонуклеоти- [c.161]

В исходной культуре пневмококков содержатся мутанты, устойчивые к пенициллину. При воздействии на культуру этим антибиотиком гибнут все клетки, кроме мутантных последние после размножения образуют культуру Р. Из нее извлекается ДНК. При добавлении этой ДНК к исходной культуре в ней возникает значительно больше / -мутантов, чем в отсутствие трансформирующего фактора. Если число спонтанных Р-мутантов составляло 1 на 10 клеток, то в результате трансформации оно увеличивалось на 4—5 порядков. [c.487]

Рекомбинантными плазмидами трансформируют клетки Е. соИ НЕ 101 и выращивают их в жидкой среде, а затем инфицируют бактериофагом X. Если в хозяйской клетке экспрессируется ген фермента рестрикции, то она оказывается устойчивой к литическому действию фагов типа X, ДНК которых активно расщепляется синтезируемой рестриктазой. [c.248]

Введение генов непосредственно с помощью Ti-плазмид не используется, поскольку приводит к образованию опухолевых клеток, из которых невозможно получить целое растение. Для этих целей применяют векторные молекулы на основе Ti-плазмид с удаленными онкогенами. Вместо онкогенов в вектор можно встраивать стандартными методами по сайтам рестрикции последовательности клонируемой ДНК [193, 194]. В таких челночных векторных плазмидах сайты рестрикции, по которым производят клонирование, расположены в искусственной Т-области, фланкированной вышеупомянутыми повторами. В качестве селектируемых маркеров в этих плазмидах используют расположенные в Т-области гены устойчивости к антибиотикам или гербицидам, которые позволяют отбирать трансформированные клетки растений. После введения клонируемой последовательности рекомбинантным вектором трансформируют клетки агробактерий и с их помощью при участии vzr-генов осуществляют перенос всей генно-инженерной конструкции в клетки растений. Гены вирулентности могут находиться как в составе самого вектора, так и в ira/15-положении на плазмиде-помощнике. Для получения генетически модифицированных растений суспензию агробактерий можно инкубировать с протопластами, интактными клетками, тканями, листьями или даже целыми растениями. Во всех случаях достигается высокоэффективный перенос рекомбинантной ДНК в геном трансформируемых клеток. Интеграция рекомбинантной ДНК происходит случайным образом с небольшим предпочтением участков активно транскрибируемых генов. [c.140]

Учитывая ТОТ факт, что в 1 см каллусной культуры содержится до 1 млн. клеток, каждая из которых способна трансформироваться в новое растение, становятся понятными все преимущества метода стерильного вегетативного размножения растений в лабораторных условиях-на средах с фитогормонами при последующей пересадке их в почву. Отбирая нужные клетки, можно вывести новые сорта растений, удовлетворяющие запросы по одному или ряду показателей (устойчивость к микробным заболеваниям, урожайность, особая окраска цветов, повышенная продуктивность вторичных метаболитов и т. д.). [c.507]

Часть культуры затем переносят на среду, содержащую стрептомицин нетрансформированные клетки на ней погибают, а устойчивые выживают в конце опыта их можно сосчитать. Таким путем можно количественно выявить только относительно небольшое число трансформированных клеток. Именно трудностью обнаружения, возможно, объясняются неудачи при попытках трансформировать не бактерии, а другие организмы. [c.302]

Рис. 8.3. Олигонуклеотид-направлен-ный мутагенез с использованием плазмидной ДНК. Ген-мишень встраивают в полилинкер вектора pALTER. Плазмидную ДНК денатурируют в щелочи и отжигают с тремя олигонуклеотидами мутагенным олигонуклеотидом, олигонуклеотидом, восстанавливающим устойчивость к ампициллину (Amp ), и олигонуклеотидом, придающим чувствительность к тетрациклину (Tef ). Эти олигонуклеотиды служат затравками для синтеза ДНК с помощью ДНК-по-лимеразы Т4, а исходная цепь - матрицей. Одноцепочечные разрывы в новосинтезированной цепи зашиваются ДНК-лигазой Т4. Продуктами реакции трансформируют клетки Е. соН и отбирают трансформантов Amp и Tet.

ДНК — матрицей. Одноцепочечные разрывы в новосинтезированной цепи зашиваются с помощью ДНК-лигазы Т4. По окончании синтеза и лигирования продуктами реакции трансформируют клетки Е. соН. Трансформантов отбирают по признаку устойчивости к ампициллину и чувствительности к тетрациклину. Примерно 90% из них содержат специфическую мутацию в клонированном гене. У остальных трансформантов клонированный ген не был изменен либо потому, что олигонуклеотид не гибридизо-вался с ним, либо потому, что он вытеснялся в ходе синтеза ДНК. Клетки, несущие мутантный клонированный ген, идентифицируют с помощью гибридизации. Все плазмиды, штаммы, ферменты, олигонуклеотиды (кроме того, который предназначен для изменения клонированного гена), а также буферы продаются в наборе, что облегчает работу. [c.163]

Таким путем получают множество фрагментов исходной ДНК, встроенных в ДНК вектора (клонотеку). Далее рекомбинантными ДНК трансформируют клетки бактерии-хозяина (специальные штаммы E. oli, не содержащие других плазмид или фаговых ДНК). В разные клетки могут попадать разные фрагменты ДНК донора (или вообще не попадать). Поэтому клетки рассевают таким образом, чтобы потомство каждой из них (клон) получить отдельно. При использовании плазмид в качестве векторов отбирают только клоны, выживающие в присутствии антибиотика, ген устойчивости к которому не содержит сайта рестрикции использованной рес-триктазы. Это тест на присутствие плазмиды в клетке хозяина. [c.104]

Если теперь трансформировать клетки компетентной культуры Е. oli плазмидой pBR322 со встроенным в нее фрагментом, то трансформантов можно отобрать на среде с ампициллином. Далее необходимо их проверить по признаку устойчивости к тетрациклину. Если исходная клетка была трансформирована интактной [c.273]

Часть полученной таким образом культуры пневмококков переносили на среду со стрептомицином, убивающим все нетрансформированные клетки. В результате указанной обработки остаются только устойчивые к стрептомицину клетки и им можно дать количественную оценку. В опыте Хочкиса получилось около 17% трансформн-рованных клеток. Эга величина зависит от многих факторов, например от подбора клёток-реципиентов. Некоторые штаммы характеризуются весьма высокой восприимчивостью к трансформирующему фактору. Трансформация определяется также концентрацией ДНК и временем ее воздействия на клетки. Наиболее удачным для трансформации моментом является период, наступающий сразу же после клеточного деления. [c.85]

Из данных шестой строки табл. 18.11 следует, что не все лимфомы Т-клеток обладают сходным типом инактивации. Рестриктаза Xho I инактивирует трансформирующую активность ДНК, выделенной из двух линий мышей, BALB/ и С57, но неспособна к инактивации трансформирующей активности ДНК четырех линий клеток человека. Вероятно, все эти клетки содержат общий онкоген, расщепляемый Ват HI и Hind III, но не Есо RI. Таким образом, данный ген является полиморфным по устойчивости к рестриктазе Xho I. [c.327]

В устойчиво грансформированной вирусом клетке должно установиться равновесие, вирус не должен убивать клетку, а клетка должна сохранять вирусные гены при размножении (передавать из поколения в поколение). Обычно это осуществляется путем интеграции этих генов в одну или более клеточных хромосом. По иногда вирусные гены существуют в клетке в виде плазмиды, реплицирующейся одновременно с хромосомами. Так, вирус 8У40 и ретровирусы встраиваются в хромосомы клеток, которые они трансформируют папилломавирусы - класс ДПК-содержащих вирусов, вызывающих у человека образование бородавок (и, вероятно, участвующих в возникновении рака шейки матки). [c.466]

Допустим, что у Вас имеется устойчивый к ми-томицину (А), тетрациклину (В), канамицину (С) и нистатину (Д) штамм Ba illus subtilus № 2 и чувствительный штамм № 1, из которого получен штамм № 2. Можно экстрагировать ДНК из штамма № 2 и трансформировать ею штамм № 1. Затем, высеяв обработанные ДНК клетки штамма № 1 на агар, содержащий различные комбинации антибиотиков. Вы, предположим, получили следующие результаты (цифры обозначают число колоний, выросших на чашке) среда без антибиотиков — 10000 митомицин — 1156 тетрациклин—1148 канами-цин —1161 нистатин—1139 митомицин + тетрациклин —46 митомицин -f канамицин — 64Ю митомицин + + нистатин —942 тетрациклин + канамицин —51 тетрациклин + нистатин —49 канамицин + нистатин —786. Какие гены сцеплены и в каком порядке они располагаются в молекуле ДНК [c.116]

С появлением методологии генной инженерии метод локализованного мутагенеза становится доступным для широкого круга микроорганизмов. В наиболее простом варианте клонированный фрагмент ДНК, ограниченный удобными сайтами рестрикции, может быть выделен и подвергнут мутагенезу in vitro. Вследствие проведения реакции in vitro дозы мутагена могут быть достаточно высокими, что сильно повышает частоту мутагенеза. Такой подход использован при создании штамма-продуцента гомосерина (см. гл. 4). Для получения стабильных неревер-тирующих мутаций в определенном гене можно применить метод инсерционного локализованного мутагенеза. С этой целью инактивируемый ген клонируют на плазмиде и встраивают в него детерминант устойчивости к антибиотику (рис. 29). Затем компетентные клетки трансформируют сконструированной гибридной плазмидой (или полученной при ее расщеплении линейной молекулой ДНК), содержащей указанный детерминант, фланкированный последовательностями, гомологичными хромосомному гену. В результате двойного кроссинговера происходит интеграция гена лекарственной устойчивости в гомологичный район хромосомы. Искомые трансформанты отбирают на селективных [c.160]

Кольцевые YA имеют ряд преимуществ перед линейными. Во-первых, они легко выделяются из суммарной дрожжевой ДНК, поскольку кольцевые молекулы задерживаются в стартовом положении при гель-электрофорезе с пульсирующим полем (см. приложение). Во-вторых, они более устойчивы к разрывам при манипуляциях. В-третьих, введение в исходный вектор репликатора из F-плазмиды позволяет переносить YA в клетки Е. oli, трансформируя их суммарной дрожжевой ДНК. [c.361]

Трансформация эмбриональных фибробластов крысы двумя онкогенами. При введении двух онкогенов в первичные эмбриональные фибробласты крысы возможен отбор трансформантов по фокусам морфологической трансформации без введения доминантных маркеров устойчивости. Процедура получения морфологических трансформантов при обработке клеток кальцийфосфатным преципитатом ДНК такая же, как описано выше. Смесь двух плазмид, которыми трансформируют первичные эмбриональные фибробласты, растворяют в буфере Б и формируют преципитат, которым обрабатывают клетки. Суммарное количество ДНК на 60 мм чашку, в которой находится 3 10 клеток, не должно превышать 20 мкг. Через сутки клетки рассевают и, меняя каждые 3 сут среду, ожидают появление фокусов морфологической трансформации, которые формируются через 18—21 сут после обработки клеток преципитатом плазмидной ДНК. Затем фокусы выделяют с помощью титановых цилиндров и после размножения клеток определяют гибридизацией по Саузерну присутствие двух онкогенных последовательностей, вводимых в составе различных плазмидных векторов. Выделенные трансформантные клоны можно использовать для изучения различных аспектов канцерогенеза (in vitro и in vivo). [c.230]

А. С. Бойцов и В. И. Голубков (1980 г.) обнаружили, что плазмиды стрептококков могут эффективно трансформировать В. subtilis и обусловливать их устойчивость к антибиотикам. При этом наибольшая эффективность трансформации и стабильность поддержания характерна для плазмид с протяженными инвертированными повторами. Такие повторы могут занимать до 80 % контурной длины плазмиды (например pSM22095). Клетки В. subtilis трансформируются плазмидами данного типа в мономерной форме с такой же эффективностью, как и суммарным препаратом плазмиды. [c.246]

ЛЯЛИ суммарную клеточную ДНК и трансформировали полученным препаратом компетентные клетки Е. oli. Бактериальные клетки, трансформированные нативной плазмидой, образовывали ампициллин-устойчивые колонии. Число трансформантов определяли на весь образец ДНК (приведены результаты трех независимых экспериментов) [c.336]

Смотреть страницы где упоминается термин Трансформированные клетки, устойчивые: [c.295] [c.362] [c.111] [c.189] [c.216] [c.121] [c.111] [c.249] [c.282] [c.284] [c.290] [c.467] [c.482] [c.312] [c.168] [c.299] [c.301] [c.118] [c.164] [c.109] [c.90] [c.358] [c.417] [c.87] [c.389]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология