Молекулярный вектор клонирующий

Разработка методов генетической инженерии, позволяющих клонировать в составе молекулярных векторов отдельные гены любых организмов и вводить их в гетерологичное окружение клетки-реципиента, открыла прекрасные перспективы для решения такого фундаментального вопроса биологии, как экспрессия эукариотических генов в бактериальной клетке. [c.157]

Использование ПЦР для клонирования заданных фрагментов ДНК. Появление метода ПЦР значительно упростило процедуру точного извлечения из состава молекул ДНК известных нуклеотидных последовательностей и встройки их в молекулярные векторы. Могут быть рассчитаны последовательности олигонуклеотидных праймеров, которые обеспечивают не только точную амплификацию требуемого фрагмента, но и одновременно позволяют вводить участки гидролиза определенных рестриктаз (рис. 1.34), необходимые для запланированной встройки в клонирующий вектор. При этом количество исходной ДНК, содержащей целевую последовательность, может быть очень малым. [c.54]

Основная цель экспериментов по клонированию генов, которые предполагается использовать в биотехнологии, — подбор условий для эффективной экспрессии в нужном организме-хозяине. К сожалению, сам факт встраивания того или иного гена в клонирующий вектор еще не означает, что этот ген будет экспрессирован. В то же время, чтобы получение коммерческого продукта было экономически оправданным, уровень его синтеза должен быть достаточно высоким. Для достижения эффективной экспрессии уже сконструировано много специфических векторов для этого проводились манипуляции с целым радом генетических элементов, контролирующих процессы транскрипции и трансляции, стабильность белков, секрецию продуктов из хозяйской клетки и т. д. Среди молекулярно-биологических свойств систем экспрессии наиболее важны следующие 1) тип промотора и терминатора транскрипции 2) прочность связывания мРНК с рибосомой 3) число копий клонированного гена и его локализация (в плазмиде или в хромосоме хозяйской клетки) 4) конечная локализация синтезируемого продукта 5) эффективность трансляции в организме хозяина 6) стабильность продукта в хозяйской клетке. [c.105]

Частным слз аем клонирующих векторов являются экспрессирующие векторы. Это молекулярные векторы, которые наряду с амплификацией обеспечивают правильную и эффективную экспрессию чужеродных генов в клетках-реципиентах. [c.32]

К моменту появления методологии генетической инженерии колифаг Я по сравнению с другими вирусами бактерий был наиболее полно изучен генетически и молекулярно-биологически. Это и обусловило то, что наряду с плазмидными векторами уже в 1974 г. появилась серия клонирующих векторов на основе фага Я. [c.97]

Для генетического анализа какого-либо вида организмов необходимо выявление мутантов с определенными физиологическими дефектами (отличиями от особей, принятых за дикий тип). До недавнего времени такие мутанты получали только в результате статистического (случайного, ненаправленного, общего) мутагенеза популяции организмов с последующей селекцией или отбором мутантов, обладающих характерным фенотипом. Измененный ген в выделенных мутантах может быть затем локализован на геноме путем комплементационного или рекомбинационного анализа с другими мутантами или методами физического картирования. Появление методов генетической инженерии позволило с помощью клонирования в молекулярных векторах извлекать отдельные гены даже из очень больших и сложно организованных геномов. Для клонированных генов может быть расшифрована последовательность нуклеотидов, а на ее основе — аминокислотная последовательность кодируемого белка. Более того, можно клонировать, а затем сравнивать последовательности гена (белка) дикого типа и мутантных форм. Исходя из полученной информации можно определить, какие изменения структуры гена (белка) приводят к тому или иному изменению фенотипа организма. [c.171]

Важное свойство векторов на основе ВРУ-1 состоит в том, что они практически являются плазмидами морфологически трансформируемых ими эукариотических клеток и в их составе можно клонировать крупные фрагменты ДНК. В целом использование вируса папилломы быка в качестве молекулярного вектора, несомненно, полезно и дополняет систему клонирования и изучения функционирования генов в различных клетках млекопитающих. [c.371]

В работах по генетике микроорганизмов часто используют термин клон , под которым подразумевают популяцию генетически родственных клеток, полученную неполовым путем из одной родительской клетки. В молекулярной биологии клоном называют множественные копии идентичных последовательностей ДНК, полученные при их встраивании в клонирующие векторы (например, плазмиды). Под термином генетически модифицированные , или рекомбинантные , штаммы понимают штаммы микроорганизмов, полученные в результате генно-инженерных манипуляций. Часто новые штаммы микроорганизмов получают с помощью мутагенов. [c.191]

Клонируя гены секретируемых белков и удаляя затем кодирующую последовательность зрелой формы, можно создать молекулярные векторы экспрессии-секреции для грамположительных бактерий рода Ba illus. В первую очередь данный подход был реализован применительно к гену атуЕ. Этот ген кодирует -ами-лазу — один из наиболее изученных и имеющих практическое значение секретируемых ферментов многих штаммов бацилл. Бактери- [c.250]

Смит Д.П. Нитевидные фаги в качестве клонирующих векторов // Сельскохозяйственная биология Векторные системы молекулярного клонирования. М. Мир, 1991. С. 65-90. [c.121]

Благодаря созданию клонирующих векторов, способных реплицироваться и стабильно поддерживаться в разных грамотрицательных бактериях, появилась возможность получать библиотеки генов изучаемых бактерий, проводить молекулярно-генетические исследования организации и функционирования хромосомных и плазмидных генов, а также координируемо регулируемых наборов генов (оперонов). С помощью комплементационного анализа удается выявлять гибридные молекулы ДНК, несущие определенные локусы бактериальной хромосомы. При этом комплементация функций возможна и в неродственных, но относительно хорошо изученных бактериях. Рассмотрим некоторые исследования такого типа. [c.228]

Создавая на основе природного репликона удобные клонирующие векторы, необходимо прежде всего достаточно подробно изучить генетическую организацию данной автономно реплицирующейся молекулы ДНК и лишь затем выполнить ряд манипуляций по ее реконструкции. На получение каждого такого вектора, как правило, уходит много времени. Особенно это касается слабо изученных в генетическом плане видов бактерий. Поэтому крайне привлекательным выглядит подход, который предусматривает создание векторных молекул, способных стабильно реплицироваться в различных хозяевах. По сравнению с конструированием отдельных молекулярных векторов для каждого бактериального вида это, во-первых, существенно экономит время и, во-вторых, обеспечивает возможность изучать экспрессию любых генов в различном генетическом окружении в составе одной и той же генетической конструкции. Часто в этой схеме экспериментов грамотрицатель-ная бактерия Е. соИ, как наиболее хорошо разработанная генно-инженерная система, используется в качестве промежуточного хозяина. [c.211]

Создание набора клонирующих молекулярных векторов и достигнутое понимание организации генов Ba illus дали толчок исследованиям по экспрессии чужеродных генов в В. subtilis. Особое значение для данной генно-инженерной системы имеет секреция целевых белков из клеток в окружающую среду, поэтому существенная часть этих экспериментов описана в разд. 10.2.4. [c.265]

Важным преимуществом молекулярных векторов на основе S P2 является возможность клонировать в них большие (до 30 тпн) фрагменты ДНК. В совокупности свойства рассмотренных плазмид делают их весьма перспективными для клонирования оперонов биосинтеза антибиотиков. [c.277]

Рис. 2 дает представление о размерах хромосомных сегментов, в пределах которых работают различные современные методы генетических исследований. Ось ординат представляет собой логарифмическую шкалу физических расстояний, измеренных в парах (или в тысячах пар) нуклеотидов (п.н. или т.п.н,). На шкале приведены и значения генетических расстояний, измеряемые в сантиморганидах (сМ). 1 сМ приблизительно равна 10 п. н. Однако это соотношение нельзя считать универсальным, ибо зависимость между генетическим и физическим расстоянием на хромосоме имеет нелинейный характер, на нее могут оказывать влияние горячие точки рекомбинации. Наличие таких областей может привести к ситуации, когда сравнительно большому генетическому расстоянию соответствует небольшой отрезок на физической карте. В то же время в геноме существуют участки, рекомбинация в которых маловероятна, а это приводит к обратной ситуации. Как показано на рис. 2, классические методы молекулярной генетики хорошо работают на последовательностях длиной до 50 г. п. н., что соответствует максимальному размеру вставки в космидный вектор. Участки большей длины можно клонировать путем прогулки по хромосоме , когда, используя уже клонированные последовательности, геномную библиотеку скринируют с целью получения перекрывающихся клонов. Таким способом удаётся анализировать последовательности длиной до нескольких сотен т. п. н. Однако, в [c.96]

Молекулярные клонирующие векторы играют ключевую роль в постановке генно-инженерных экспериментов на выбранной системе клеток. В системе клеток прокариот и низших эукариот в качестве векторных молекул используют плазмиды или ДНК вирусов. В культивируемых клетках млекопитающих эндогенные плазмиды не найдены, поэтому внимание исследователей сконцентрировалось на ДНК-со-держащих вирусах. К моменту появления генно-инженерной методологии наиболее хорошо изученным в генетическом и биохимическом плане был вирус SV40. Имелись методы наработки и очистки данного вируса, выделения его ДНК и трансфекщ1и ею чувствительных культур клеток. Поэтому именно на основе ДНК вируса SV40 бьши созданы первые клонирующие векторы культивируемых клеток млекопитающих. [c.354]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология