Зависимость разрешения от скорости элюирования

Зависимость разрешения от скорости элюирования [c.250]

Поскольку при элюировании фронт растворителя неразличим, скорость движения растворителя определяют и регулируют с помощью соединений-маркеров. Для этой цели служат окрашенные белки природного происхождения, например гемоглобин и цитохром с [9] или же белки с флуоресцентной меткой, присоединенной, например, с помощью флуоресцеинизотиоцианата [8]. Однако наиболее подходящими и хорошо различимыми маркерами являются, по-видимому, бычий сывороточный альбумин и альбумин человека, окрашенные амидо-черным В [14]. Декстра-новый синий, применяемый в гель-фильтрации на колонках для определения свободного объема, является плохим маркером, поскольку при фракционировании он имеет обыкновение давать хвосты . В зависимости от скорости движения маркеров регулируют угол наклона пластинки, задавая тем самым скорость движения элюента. При работе на сефадексе 0-200 скорость веществ, мигрирующих со свободным объемом (т. е. не проникающих в гранулы геля), не должна превышать 2 см/ч на гелях сефадекса с более высокой степенью сшивки скорость может быть несколько больше. Указать заранее оптимальный угол наклона для данного типа геля невозможно, поскольку он зависит от многих факторов, например от свойств партии геля и консистенции суспензии. Пробег для веществ, мигрирующих со свободным объемом, должен составлять не менее 15 см. При большем пробеге (до 30—40 см) наблюдается лучшее разрешение и вместе с тем не происходит заметного размывания зон. [c.260]

Перед началом исследования образцов полимеров колонки хроматографа градуируют по нескольким эталонным образцам полистирола и полиоксиэтилена с неразветвленной цепью и узким молекулярно-весовым распределением с целью получения зависимости длинч цепи полимера Л (А) от VI (мл). Затем производят ориентировочные быстрые опыты, используя одну колонку 10 А. Эти опыты позволяют выбрать оптимальные условия гелевой хроматографии с использованием одной или нескольких колонок с пористостью, соответствующей молекулярно-весовому распределению полимера. На рис. 9 и 10 сравниваются хроматограммы ориентировочного характера и высокого разрешения для характеристики МВР смеси латексов и полиуретана. В последнем случае отчетливо виден эффект выбора оптимальной хроматографической колонки. Небольшой перегиб у 10 А на колонке 10 А превращается на колонке 10 А в хорошо заметный хроматографический пик у 2> 10 А. Если поддерживать скорость элюирования 1 мл мин, то для получения гелевой хроматограммы на одной колонке требуется 55 мин Поскольку объем подвижной фазы колонки составляет 25 мл, первая фракция полимера появится через 25 мин после начала хроматографии. Соответственно для завершения гелевой хроматографии на четырех последовательно соединенных колонках необходимо 4 час, и первая фракция полимера появится спустя [c.102]

При проведении гель-фильтрации в препаративном масштабе, например при очистке ферментов и антител, часто приходится идти на компромисс, выбирая между высокой степенью разрешения и большой скоростью потока. Таким образом, хорошее разделение в какой-то мере приносится в жертву при использовании более крупных частиц геля, позволяющих быстрее пропускать через колонку нужный объем жидкости. Пористость частиц должна быть подобрана (часто эмпирически) так, чтобы можно было разделить как можно больше компонентов и чтобы на кривой элюирования нужный компонент располагался между Уо и Уо+У1. Для этого успешно применяется либо только одна гель-фильтрация, либо гель-фильтрация в сочетании с другими способами разделения. Молекулярную массу растворимых белков можно определять с помощью гель-фильтрации на сефа-дексах 0-75 и 0-100 [30, 50]. Для этого строят график линейной зависимости отношения Ух1Уо, где Ух — объем пика неизвестного компонент-э, а Ко — свободный объем, от логарифма молекулярной массы ряда ферментов и белков с известными молекулярными массами. Молекулярную массу неизвестного компонента находят по графику. Этот очень полезный метод в основном вытеснен сейчас другим, более быстрым и удобным методом диск-электрофореза в геле (разд. 16.5.1). [c.225]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология