Двумерный электрофорез в ПААГ

Даже если количество белка очень невелико, его молекулярную массу и субъединичный состав можно определить, используя ДСН-электрофорез в ПААГ. В случае двумерного электрофореза белки разделяют на отдельные фракции изоэлектрическим фокусированием в одном направлении, после чего следует ДСН-электрофорез во втором направлении. Этот метод может быть использован для разделения тех белков, которые в норме считаются нерастворимыми. [c.221]

Анализ субъединиц глютенина с помощью электрофореза при кислых pH или двумерного электрофореза ДДС-ПААГ-ИЭФ или ДДС-ПААГ в формирующемся градиенте pH обнаруживает значительные различия их зарядов. Каждую полосу, наблюдаемую при одномерном электрофорезе и соответствующую определенной молекулярной массе, можно посредством электрофокусирования разделить на большое число белков, отличающихся своими изоэлектрическими точками. Так, по Данно и др. [57], субъединицы с предполагаемой молекулярной массой в пределах [c.208]

Во втором направлении белки разделяли ступенчатым электрофорезом в пластине ПААГ размером 13X14 см и толщиной 0,8 мм. В качестве рабочего геля до уровня на 2,5 см ниже верхнего края пластины полимеризовали экспоненциальный градиент (5—22,5%) ПААГ в 0,375 М Трис-НС1 (pH 8,8) с добавлением 0,1% ДДС-Na, стабилизированный глицерином. Формирующий гель представлял собой 4,75%-ный ПААГ, полимеризованный в 0,125 М Трис-НС1 (pH 6,8) с 0,1% ДДС-Na. Клиновидную полость над пластиной для помещения в нее цилиндри-, ка геля первого направления формировали так, как это принято делать при двумерном электрофорезе [Остерман, 1981]. Эту полость заполняли расплавленным 1%-ным раствором агарозы в том же буфере, а затем закладывали в нее цилиндрик геля. В качестве верхнего электродного буфера использовали, как обычно при электрофорезе по Лэммли, раствор, содержащий 0,025 М Трис, 0,192 М глицин и 0,1 % ДДС-Na (pH 8,3) с добавлением бромфенолового синего в качестве лидирующего красителя. Электрофорез длился 5 ч при силе тока 20 мА. За это время полоса красителя достигала нижнего края пластины. Для окрашивания белков после электрофореза использовали 0,1%-ный раствор СВВ R-250 в 50%-ной ТХУ. Перед авторадиографией гель высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой от суток до месяца в зависимости от исходной радиоактивности препарата и необходимости выявления слабых пятен. Прн этом следует иметь в виду, что при увеличении продолжительности экспозиции увеличивается и размер каждого пятна — примерно вдвое при 10-кратном удлинении экспозиции. Соответственно может ухудшаться разрешение близко лежащих пятен. [c.47]

Комбинация электрофореза в кислой мочевине с Тритоном Х-100 в первом направлении и такой же системы, но с цетавлоном вместо Тритона, во втором позволила Боннеру и соавторам выявить значительное число дополнительных фракций при разделении гистонов двумерным электрофорезом. В обоих направлениях использовалась система ступенчатого электрофореза (3,3 /о-ный ПААГ — формирующий, 15%-ный — рабочий). Полимеризацию вели с рибофлавином. После электрофореза в первом направлении белки фиксировали и окрашивали СВВ. При этом отпадала необходимость вести электрофорез во, втором на- [c.87]

Тени эритроцитов, полученные путем гипоосмотического гемолиза и отмытые от гемоглобина в изотоническом буфере, содержат около 50 % белков, 43 % липидов и 7 % углеводов. Белковые компоненты мембраны были идентифицированы методом электрофореза в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия. В соответствии с локализацией их подразделяют на периферические и интегральные (см. главу 1). Периферические белки расположены на поверхности мембраны и им соответствуют полипептидные полосы 1, 2, 4, 5 и 6. Интегральные белки погружены в липидный бислой и в некоторых случаях пронизывают его. Основным интегральным белком является белок полосы 3, осуществляющий транспорт анионов через мембрану. Его М-конец находится с цитоплазматической стороны, а С-конец погружен в бислой с наружной стороны мембраны. Периферические белки взаимодействуют друг с другом, образуя двумерный каркас, выстилающий внутреннюю поверхность эритроцитарной мембраны, который называют мембранным скелетом. Он содер- [c.230]

Рис. 10-2. Сравнение двумерных электрофореграмм, различающихся первым этапом разделения. Суммарный лизат клеток линии 70Z/3 (пре-В-клеточная лимфома), меченный -метионином, анализировали, используя для разделения в первом направлении ИЭФ (слева) и НЭГрН (справа). Разделение во втором направлении проводили с помощью электрофореза в 10%-ном ДСН-ПААГ (разделение белков по размеру).

В 1975 г. О Фаррелл опубликовал сенсационные результаты двумерного фракционирования радиоактивно меченных суммарных белков Е. oli. В первом направлении он использовал ИЭФ, а во втором — ступенчатый электрофорез в присутствии ДДС-Na с использованием градиента концентрации ПААГ. По окончании фракционирования на пластине методом авторадиографии было выявлено около 1100 пятен различных белков (рис. 14). Метод О Фаррелла получил очень широкое распространение. Разумеется, за 5 лет он претерпел ряд дальнейших модификаций, которые будут рассмотрены ниже, но сначала отметим характерные особенности оригинального метода, избегая деталей, подробно описанных автором в его первой работе [O Farrell, 1975]. [c.45]

Этот метод количественного двумерного, или, как его чаще называют, перекрестного иммунозлектрофореза является комбинацией рассмотренных выше методов [ larke, Freeman, 1967]. Сначала в первом направлении смесь белков-антигенов разделяют обычным электрофорезом в агарозе (или ПААГ). Затем следует электрофоретическая миграция разделившихся антигенов в перпендикулярном (втором) направлении. Миграция идет в геле агарозы, смешанной с полифункциональной антисывороткой против исходной смеси антигенов. Каждый белок-антиген во втором направлении мигрирует независимо от других и образует зоны преципитации, подобные ракетам Лорелла , но более широкие у основания и напоминающие обычные хроматографические пики. Эта форма пиков обусловлена тем, что миграция начинается не из резко очерченной лунки, заполненной одинаковым по всему ее объему раствором антигена, а из более или менее размытой белковой зоны, образовавшейся в результате электрофореза в первом направлении. [c.144]

Особенно совершенной оказалась двумерная система фракционирования белков и пептидов, предложенная О Фаррелом [O Farrel, 1975]. В этой системе во втором направлении также использована методика Лэммли в сочетании с градиентом пористости ПААГ. Подробный разбор системы О Фаррела и ее модификаций здесь провести нельзя, поскольку в первом направлении в ней используется не электрофорез, а электрофокусирование. [c.73]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология