Ампликон

Рис. 21.9. Вектор на основе HSV-ампликон-плазмиды. Точка инициации репликации HSV (ori HSV), сигнал упаковки HSV и терапевтический ) ген (ТГ) встраивают в плазмиду Е. соН (HSV-ампликон-плазмида). Проводят трансфекцию клетки-хозяина, инфицированной вирусом-помощником HSV, полученной плазмидой. ДНК ампли-кон-плазмиды реплицируется по типу катящегося кольца . 10 амп-ликонов, соответствующих полноразмерному геному HSV, упаковываются в HSV-капсид, который поставляет вирус-помощник HSV. Геном этого вируса не упаковывается. HSV-частицы, несущие множество копий терапевтического гена, высвобождаются при лизисе клетки и используются для трансдукции нейронов.

Замена сегмента генома длиной примерно 30 т. п. н. ДНК-вставкой не оказывает заметного влияния на репликацию HSV, его упаковку или инвазионную способность. С другой стороны, большой размер генома HSV затрудняет генетические манипуляции с ним. Для решения этой проблемы в плазмиду Е. соН, которая может переносить до 8 т. п. н. чужеродной ДНК, встроили усеченный геном HSV, состоящий из точки инициации репликации и последовательности, ответственной за упаковку. Полученные HSV-производные назвали ампликонами (ампликон-плазмидами). [c.498]

При использовании стандартных праймеров Скорпион имеет место некоторое тушение флуоресценции даже после их гибридизации с ампликоном, из-за пространственной близости флуорофора и тушителя флуоресценции. Дальнейшее усиление интенсивности сигнала в этой системе достигается путем отделения флуорофора и тушителя друг от друга, которые связывают с отдельными олигонуклеотидами, комплементарными друг другу (рис. 25, б). [c.233]

Процесс накопления продуктов в ходе ПЦР достаточно сложен, чтобы быть выраженным какой-нибудь простой (относительно, конечно) математической формулой. Так, кроме начавшейся с третьего цикла, амплификации целевых фрагментов ДНК, ограниченных с обеих сторон праймерами, с каждым новым циклом в цепную реакцию вовлекаются вновь синтезированные по гетерогенным матрицам подобные ампликоны. При этом одновременно продолжается увеличение числа самих гетерогенных матриц, комплементарных цепям исходного фрагмента ДНК. Как можно видеть из упрощенной (поскольку приведены нарабатывающиеся ПЦР-продукты только для одной из двух исходных цепей ДНК, обозначенной здесь прямой линией - впрочем, для комплементарной цепи, обозначенной волнистой линией, эта схема полностью справедлива) схемы протекания ПЦР, изображенной на рис, 3.1, в первом цикле образуются только гетерогенные по размеру цепи ДНК (продукт А), так как их терминация будет происходить произвольно. Только во втором цикле в реакционной смеси появляются целевые фрагменты ДНК, причем комплементарные цепи этого фрагмента (А1) на этом этапе спарены с гетерогенными матрицами и для большей наглядности расположены в нижней части схемы. В верхней части схемы, для которой на данном рисунке некой демаркационной линией служит одна из цепей исходного фрагмента ДНК, продолжающая также служить матрицей и в последующих циклах, изображены целевые фрагменты определенного размера, ограниченные по краям праймерами. Дальнейшее накопление таких фрагментов (А1,А2,АЗ,А4..., В1,В2... и т.д.) происходит экспоненциально, тогда как первый тип гетерогенных молекул (А, В, С, О, Е и т.д.) будет накапливаться только в арифметической прогрессии. Таким образом, например, после 25 циклов такие гетерогенные молекулы будут составлять ничтожную часть, которой, в подавляющем большинстве случаев, можно просто пренебречь. [c.137]

Векторная система ампликона вируса простого герпеса имеет ряд особенностей, отличающих ее от эукариотических векторов других типов. Гибридная ДНК, состоящая из ампликона, соединенного с чужеродной последовательностью, реплицируется по механизму катящегося кольца и упаковывается в капсид как линейная молекула размером около 150 тпн. Поэтому в данном случае можно клонировать фрагменты ДНК, значительно варьирующие по длине. Также необходимо отметить, что популяция вирусов, содержащая гибридные дефектные геномы, может быть использована для инфекции практически любых культур клеток млекопитающих. [c.389]

Большинство систем доставки генов на основе HSV предполагает использование вируса-по-мощника, который поставляет белки, необходимые для репликации и сборки вируса, но не образует инфекционные вирусные частицы, поскольку его геном модифицирован и не способен упаковываться. Для получения рекомбинантного HSV осуществляют трансфекцию ампликон-плазмиды в инфицированную вирусом-помощником клетку-хозяина. ДНК ампли- [c.498]

Ампликон (Anipli on) Плазмидный вектор вируса простого герпеса типа 1. [c.543]

Как уже упоминалось, одним из простых и эффективных методов обнаружения метилированных остатков С и А в ДНК является использование эндонуклеаз рестрикции, чувствительных к метилированию (ЭРЧМ) (см. раздел 2.2) (рис. 21, а). В этом случае инкубация изучаемой ДНК с ЭРЧМ в зависимости от статуса метилирования исследуемого участка может приводить или не приводить к разрушению ампликона и подавлению его амплификации в ПЦР. Однако, поскольку не всегда в нужных местах генома присутствуют соответствующие сайты рестрикции, применение таких ферментов имеет ограничения. При другом распространенном подходе, лишенном этого недостатка, используют способность бисульфита (HSO3) превращать в оц ДНК остатки С [c.220]

Праймер S1 и зонд гибридизуются с последовательностью, расположенной непосредственно перед делецией, и эта мутация не оказывает влияния на их взаимодействие с матричной ДНК. Место посадки праймера S2 удаляется делецией, и в этом случае соответствующий ПЦР-продукт не образуется в присутствии праймеров S1 и S2 в реакционной смеси, хотя реакция на мутантной матрице пройдет в присутствии праймеров S1 и S3, которые, в свою очередь, не функционируют на ДНК без делеции из-за слишком большого расстояния между этими праймерами. Таким образом, образование продукта ПЦР как в присутствии праймеров S1 + S2, так и S1 + S3 в реакционной смеси свидетельствует о наличии гетерозиготной делеции SEA в ДНК, как это представлено на рис. 24, б. Хотя теоретически эффективность образования продуктов ПЦР в присутствии обеих пар праймеров при наличии гетерозиготной делеции SEA должна быть идентичной, выявляемые с помощью ПЦР в реальном времени различия могут быть связаны с длинами ампликонов, поскольку все остальные условия проведения ПЦР в этих опытах были одними и теми же. С помощью серийных разведений образцов ДНК определили чувствительность системы ПЦР в реальном времени, которая в обсуждаемом примере позволяла обнаруживать 0,28 нг ( 20 копий) ДНК в пробе (рис. 24, в). [c.228]

Флуоресцентные красители, связывающиеся с ДНК. Четвертый тип систем обнаружения продуктов ПЦР в реальном времени основан на непосредственном взаимодействии флуоресцентных красителей (например, SYBR Green) с дц ДНК [308]. Краситель, не связавшийся с ДНК, обнаруживает слабую флуоресценцию в растворе, которая возрастает в результате связывания красителя дц ДНК по мере элонгации праймеров в цикле ПЦР. На стадии денатурации интенсивность флуоресценции снова уменьшается. В соответствии с этим интенсивность флуоресценции реакционной смеси измеряют в конце этапа элонгации каждого цикла. Хотя метод исключает необходимость в дополнительных флуоресцентных зондах, его специфичность низка и целиком определяется специфичностью взаимодействия праймеров с ДНК-матрицей. Тем не менее, эффективность такой системы можно повысить, фиксируя интенсивность флуоресценции суммарного продукта ПЦР как функцию от температуры плавления (TJ) ампликона. Для этого температуру реакционной смеси медленно повышают сверх значений Тм ампликона, фиксируя при этом флуоресценцию, что в ряде случаев позволяет идентифицировать сигнал, исходящий от требуемого продукта ПЦР в виде достаточ- [c.230]

З -Концевая часть олигонуклеотида Скорпион заключает в себе последовательность, комплементарную анализируемому участку ДНК, и в ПЦР выполняет непосредственную роль праймера. 5 -Концевая часть олигонуклеотида сконструирована таким образом, что образует структуру типа стебель-петля . За счет этого происходит сближение флуорофора, присоединенного непосредственно к 5 -концу Скорпиона с тушителем флуоресценции, расположенным в центральной части олигонуклеотида на границе последовательности праймера. В этом отношении пространственная структура олигонуклеотидов Скорпион напоминает таковую молекулярных маяков и выполняет ту же функцию - обеспечивает тушение флуоресценции флуорофора до тех пор, пока олигонуклеотиды находятся в свободном состоянии. Однако, в отличие от молекулярных маяков , участок ДНК, находящийся в петле Скорпиона , комплементарен последовательности нуклеотидов амплифицируемой последовательности ДНК (ампликона), что и обеспечивает ему уникальные свойства. Кроме того, непосредственно за тушителем флуоресценции в цепь ДНК вводится мономер гексэтиленгликоля (HEG), который блокирует прохождение ДНК-полимеразы вдоль матрицы до 5 -конца, т.е. прекращает амплификацию в этой точке, и последовательность, образующая структуру типа стебель-петля , остается неамплифицированной. [c.231]

Для амплификации последовательностей с использованием обычной ПЦР необходимо знание первичной структуры обеих последовательностей, фланкирующих анализируемый ампликон, что является существенным ограничением использования метода в анализе последовательностей неизвестной структуры. В исследовательской работе часто встречаются ситуации, когда известна последовательность, расположенная с одной стороны ампликона, а другую требуется определить, то есть совершить переход от известной последовательности генома к соседней неизвестной. Для решения этой задачи создано несколько методов, объединенных под общим названием односторонней ПЦР (single-sided P R). [c.233]

Таким образом, с помощью HSV-ампликона можно эффективно амплифицировать чужеродную генетическую информацию в клетках животных. Более того, если ампликон объединен с бактериальной плазмидой, то, выщепляя из дефектного генома гибридного вируса повторяющуюся единицу, можно восстановить исходную гибридную плазмиду и размножать ее в бактериальных клетках. При необходимости плазмиду можно снова ввести в клетки животных совместно с вирусом-помощником или его ДНК. [c.389]

Начиная с третьего цикла, происходит экспоненциальная амплификация именно целевых фрагментов ДНК, ограниченных с обеих сторон праймерами. В то же время с каждым новым циклом в цепную реакцию вовлекаются вновь синтезированные по гетерогенным матрицам целевые ампликоны, накопление которых уже затем происходит также экспоненциально. Так, например, после 25 циклов количество подобных ампликонов превысит исходное количество молекул ДНК более чем в миллион раз. При этом одновременно в арифметической прогрессии увеличится и число гетерогенных матриц, комплементарных цепям исходного фрагмента ДНК, однако, таковые будут составлять ничтожную часть, которой, как правило, просто пренебрегают. Впрочем, процесс накопления продуктов в ходе ПЦР достаточно сложен, подчиняется своим внутренним законам и не совсем строго соответствует теоретически ожидаемому количеству амплифицированных фрагментов ДНК. [c.19]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология