Агароза активация бромцианом, связывание

Степень активации агарозы, оцениваемая данными о емкости по связыванию небольших пептидов [1], прямо пропорциональна pH. Активация проводится при pH 11. Методика активации сефарозы бромцианом детально описана ниже [2, 12, 55]. [c.189]

Хотя существует много методов ковалентного связывания лиганда с полимерным носителем, наибольшее распространение получил метод, основанный на активации носителя бромцианом 28]. Активированный носитель, например агароза или полиакриламид, вступает в реакцию с аминогруппами лиганда. Часто, чтобы облегчить комплексообразование с большими молекулами или малыми лигандными группами, между носителем и лигандом встраивают углеводородную цепь длиной до 10 атомов углерода [29—30]. При выборе лиганда следует учитывать его сродство к выделяемому белку, способ связывания, концентрацию лиганда, тип изотермы сорбции и влияние температуры. [c.110]

Ряд алкилагароз со структурой СНз(СН2)пМН—сефароза (где п принимает значения от О до 7), и-аминоалкилагароз со структурой ЫН2(СН2)п ЫН—сефароза (где п — от 2 до 8) характеризуется близким содержанием алкильных боковых цепей на гранулу геля [15, 49]. В одинаковых условиях (pH, ионная сила, состав буферного раствора и температура) способность СНз(СН2)пЫН—сефарозы удерживать фосфорилазу Ь зависит от длины углеводородных цепей. При хроматографии на производных сефарозы (я = 0 или 1) фосфорилаза Ь выходила из колонки с фронтом растворителя при п = 2 происходила задержка фермента, а при п = 3 фермент адсорбировался. Элюирование фосфорилазы Ь с модифицированной сефарозы (п = 3) возможно с помощью деформирующих буферных растворов, которые, как было показано, приводят к обратимым структурным изменениям фермента. На производном сефарозы с л = 5 связывание фосфорилазы было настолько сильным, что фермент не элюировался с колонки, даже когда pH деформирующего буферного раствора понижался до 5,8, хотя деформирующая способность такого буфера намного выше. Освободить фосфорилазу Ь из комплекса с этим производным можно только в неактивной форме после промывки колонки 0,2 М уксусной кислотой. Сама агароза содержит отрицательные заряды, а связывание алкил- или ариламинов на активированной бромцианом агарозе вводит в гель положительные заряды (разд. 8.2.4). В связи с этим йост и др. [28] обращали внимание на то, что на сефарозе с алкиламинами, прикрепленными после предварительной активации носителя бромцианом, связывание белков происходит большей частью при pH выше изоэлектрической точки выделяемых белков. Поэтому допускалось, что в этих случаях электростатические взаимодействия с положительно заряженной Ы-замещенной изомочевиной более существенны для связывания, чем гидрофобные взаимодействия с гидрофобной боковой цепью. Тем не менее гранулы агарозы не связывают фосфорилазу Ь, пока к ним не будут прикреплены алкильные боковые цепи некоторой минимальной длины. Кроме того, отмеченные выше заряды в равной мере присутствуют во всех членах гомологического ряда, и, следовательно, они не могут быть причиной различий в степени [c.152]

Присоединение аффинных лигандов к декстрановым гелям может быть осуществлено с помощью ряда методов, описанных для целлюлозы, а также агарозы (см. ниже), а именно связывание после активации бромцианом, триазиновый метод, связывание с использованием эпоксидов или бифункциональных производных или связывание через ацилазидные промежуточные соединения. [c.183]

Чаще всего связывание аффинного лиганда с агарозой проводят по методу, разработанному Аксеном, Поратом и Эрнбеком [4, 76]. После химической активации бромцианом в щелочной среде агароза ковалентно связывает соединения, содержащие первичные алифатические или ароматические аминогруппы. Степень активации, измеряемая по способности к связыванию небольших пептидов, пропорциональна значению pH в процессе активации [3], т. е. она растет с увеличением pH. Аксен и Эрнбек [3] иредложиши возможную схему процесса активации. [c.14]

Высокая стабильность бромциана в Ы-метил-2-пир-ролидоне использована Ниши,кавой и Бэйлоном [49] при изучении влияния колп-чества бромциана на активацию агарозы. На рис. 8.2 показано влияние бромциана на связывание 6-аминогексановой кислоты 6, 4 и 2%-ной агарозой. Бромциан прибавлялся в виде 16%-ного (по объему) ВОДНОГО раствора в Ы-ме-тил-2-пирролидоне. [c.192]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология