также Агароза

Для определения содержания иммобилизованного белка можно в принципе использовать все известные методы, применяющиеся при работе с растворимыми белками. Однако из-за светорассеяния, характерного для гелей агарозы, быстрого оседания их частиц, а также адсорбции красителей на гелях в определение содержания белка внесены отдельные модификации. Могут быть рекомендованы спектрофотометрический и колориметрический методы. [c.84]

Л. 6 выделяют из микросом путем центрифугирования клеточного гомогената при ускорении 105 000 g с послед, осаждением белков сульфатом аммония. Индивидуальные белки получают фракционированием с помощью хроматографии (в т. ч на гелях агарозы, содержащих ковалентно иммобилизованные фосфолипиды, и гель-фильтрацией на сефадексе), а также изоэлектрич. фокусированием в градиенте pH. Активность Л. б. определяют по перераспределению метки (изотопной, спиновой или флуоресцентной см. Липидные зонды) между донорными мембранами, содержащими меченые липиды, и немечеными акцепторными мембранами. [c.598]

Сильный подъем в применении КЭ, особенно КГЭ, а также появление в продаже промышленных приборов связаны с американским проектом "Геном человека". С помощью метода КГЭ практически полностью были разделены молекулы ДНК в реакции определения последовательности нуклеотидов ДНК или остаточных фрагментов. Из применяемых типов гелей в классическом планарном гелевом электрофорезе в капиллярах в качестве матриц применяют в основном акриламид, агарозу и целлюлозу. Эти гели очень сильно различаются по своим физическим свойствам, таким как вязкость, стабильность в электрическом поле, пористая структура и размер пор. [c.96]

Агароза (поли-р-галактопиранозил-3,6-ангидро-а-ь-галактопираноза) также часто используется в качестве носителя для иммобилизации. [c.85]

Присоединение аффинных лигандов к декстрановым гелям может быть осуществлено с помощью ряда методов, описанных для целлюлозы, а также агарозы (см. ниже), а именно связывание после активации бромцианом, триазиновый метод, связывание с использованием эпоксидов или бифункциональных производных или связывание через ацилазидные промежуточные соединения. [c.183]

И существуют некоторые готовые нерастворимые материалы имитирующие субстрат или являющиеся настоящими субстрата-тами, например крахмал (для амилаз — ферментов, участвующих в метаболизме гликогена), целлюлоза (для целлюлаз) и. фосфоцеллюлоза (см. выше), во всех остальных случаях аффинные адсорбенты необходимо синтезировать, ковалентно соединяя лиганд с подходящим носителем. При выборе носителя руководствуются теми же соображениями, что и при использовании его в качестве ионообменника — а именно носитель должен быть пористым гидрофильным полимером, который можно производить в виде частиц нужного размера, что обеспечивает свободный доступ макромолекул к соединенному с носителем лиганду и адекватный поток буфера в наполненной этим носителем колонке. При работе с глобулярными белками очень широко используются сферические гранулы агарозы, имеющие предел исключения, равный примерно 10 дальтон однако применяются и другие адсорбенты, которые в ряде случаев могут обладать теми или иными преимуществами. В настоящее время все большее распространение получают поперечно-сшитые гранулы агарозы, так как они не разрушаются и сохраняют свои размеры как под давлением, так и при смене буфера или растворителя. Обычно применяются сефароза-4В и сефароза L6B (Pharma ia), а также агарозы фирмы Bio-Rad. Здесь мы только кратко коснемся методов присоединения лиганда к матрице более полно этот вопрос освещен в последних публикациях, посвященных исключительно технике аффинной адсорбции [71—73]. Ниже перечислены основные требования к аффин-ной адсорбции. [c.147]

В качестве примеров мягких гелей можно привести крахмал, агарозу, полиакриламид, - полидекстраны для водных сред, а также полистирол, сшитый дивинилбензо-лом, и каучуки для органических сред. Жесткими гелями являются пористые стекла и силикагели. [c.80]

Целлюлоза построена из остатков моносахаридов одного типа — из остатков глюкопиранозы. Все гликозид-ные связи имеют -конфигурацию и соединяют гликозидный центр одного остатка с кислородным атомом при С-4 следующего (такие связи сокращенно обозначают Р-1- 4). Амилоза устроена аналогично, но все гликозид-ные связи имеют противоположную конфигурацию (а-). В гиалуроновой кислоте (одном из наиболее распространенных полисахаридов соединительной ткани) в цепи чередуются остатки двух разных моносахаридов — В-глю-куроновой кислоты и N-aцeтил-B-глюкoзaминa —со связями Р-1- 3 и Р-1- 4 соответственно. В агарозе, главном гелеобразующем компоненте агара, также чередуются остатки двух моносахаридов -В-галактопиранозы и 3,6-ангид-ро-а-Ь-галактопиранозы. [c.26]

Если не считать отдельных случаев гидролиза экзо-полисахаридазами, у нас пока нет возможностей перебрать полисахаридную цепь звено за звеном, выяснив тем самым полную и точную последовательность всех остатков. А деструктивные методы типа частичного гидролиза оставляют возможность для существования каких-то минорных невыявленных сегментов (как мы видели на примере агарозы). Поэтому структуры цепей, выведенные на основании даже очень подробного исследования, как правило, характеризуются некоторой неопределенностью, по крайней мере в отношении наличия (или отсутствия) какого-то числа отклонений, аномальных звеньев, а также в отношении ограниченной точности определения количественных параметров структуры (таких, например, как число разветвлений на макромолекулу). Расширение арсенала методов, примененных к данному полисахариду, и повышение их точности может, конечно, снизить верхнюю оценку для содержания миноров и для ошибки [c.108]

Если для данного, не слишком широкого интервала молекулярных масс можно выбирать из нескольких матриц, графики селективности которых перекрывают этот интервал, то предпочтительно выбрать ту из них, для которой интервал Kav будет лежать ближе к пределу исключения (область малых значений /Tav)- Фракционирование займет меньше времени, а разрешение пиков от этого выиграет кроме того, улучшатся условия для сохранения биологической активности. Ультрогели серии АсА, а также сефадексы и биогели серии Р средней и крупной пористости могут в этом плане оказаться наиболее подходящими матрицами, так как пределы исключения для них ниже, чем у других сефадексов и гелей агарозы. [c.134]

Агароза — очень гидрофильный материал с крупныл1и норами и весьма жесткой матрицей, каркас которой образуют пучки линейных молекул полимера, связанных водородными связями. Модификация происходит также по гидроксилам полисахарида, но лишь на поверхности пучков каркаса и поэтому — с относительно малой плотностью расположения ионогенных групп. Химическая стойкость невысока. Сшитые агарозы фирмы Pharma ia (типа Sepharose L ) обладают повышенной химической и тепловой устойчивостью и еще большей жесткостью, чем обычная агароза. [c.251]

К матрице аффинного сорбента, помимо общих для всех хроматографических матриц требований (нерастворимость п гидрофильпость, жесткость, подходящая форма и размер гранул, химическая стабильность в условиях модификации и в самом хроматографическом процессе, отсутствие неспецифической адсорбцип ж др.), предъявляется требование наличия химических групп, позволяющих с помощью несложной химической реакции ковалеитио связывать с матрицей разнообразные биологические молекулы (лиганды и спейсе-ры). Наиболее удобными с этой точки зрения оказались гидроксильные группы полисахаридных матриц — агарозы и сефадексов, а также амидные группировки полиакриламидного геля. Если иметь в виду аффинную хроматографию белков или использование белко- [c.342]

Связь лиганда с поли(А)-мРНК осуществляется, естественно, за счет водородных связей между основаниями двух комплементарных последовательностей — поли(и) и поли(А). На прочность этой связи влияет наличие в жидкой фазе солей, катионы которых нейтрализуют заряды остатков фосфорной кислоты в обеих последовательностях. Важную роль играют также температура среды и присутствие в ней агентов, разрывающих водородные связи, например фор-мал1ида. Все это позволяет гибко варьировать условия связывания мРНК с сорбентом и ее элюции в целях подавления неспецифической сорбции РНК других типов. В этом отношении поли(и)-агароза имеет преимущество перед аналогичным сорбентом на базе целлюлозы — олиго(с1Т)-целлюлозой, заметно более склонной к неспеци- [c.371]

Пример 3. Очистка ДНК-полимеразы а из зародыша цыпленка [Yamagu hi et al., 1982]. Аффинной хроматографии здесь также предшествовали четыре стадии ионообменной хроматографии и гель-фильтрация. Сорбция фермента на голубой агарозе в этом [c.421]

Целью работы является сравнение кинетических характеристик ГАФД, растворимой и связанной с нерастворимым носителем, а также получение иммобилизованного димера фермента и изучение его свойств. Методической основой работы является иммобилизация ГАФД на активированной бромцианом агарозе. [c.384]

А. используют при приготовлении плотных бактериальных сред, применяемых для культивирования и диагностики бактерий, а также как желнрующее в-во в пищевой (особенно в кондитерской) пром-сти. Агароза-носитель в гель-хроматографии, аффинной хроматографии, гелевом электрофорезе, иммунодиффузии и иммуноэлектрофорезе. [c.28]

Среди способов иммобилизации наиб, распространение получили ковалентное связывание фермента с матрицей и включение фермента в гель, В первом случае в качестве матрицы обычно используют целлюлозу, декстраиовые гели (сефарозу, агарозу), микропористые стекла или кремнеземы, а также синтетич. полимеры. Матрицу при ковалентной иммобилизации ферментов обычно предварительно активируют, обрабатывая, напр., бромциаиом, азотистой к-той или цианурхлоридом. Благодаря этому она становится носителем активных группировок, к-рые способны вступать в р-цию сочетания, взаимод. с группами ННг, ОН, СООН, Во втором случае в качестве гелеобразующего полимера используют полиакриламид. [c.215]

Пористое стекло (диаметр пор 5 — 250 нм), как и наиболее широко применяемые носители иа основе агарозы, отличается низкой неспецифической сорбцией и высокой емкостью. Аффинная хроматография нашла широкое применение при разделении ферментов, полнпептидных и белковых гормонов, антител, антигенов, а также транспортных и рецепторных белков. [c.354]

Б. В Иммуноэлектродиффузия или ракетный иммуноэлектрофорез [66], Гель агарозы содержит равномерно распределенную иммунную сыворотку. В лунки внесены антигенные растворы разных концентрации. Электрофоре. проводится при pH, при котооом антитела не мигрируют либо мигрируют очень мало. Антигены под действием электрического поля мигрируют в геле, содержащем антитела. Комплексы при избытке антигенов вначале растворимы, продолжают мигрировать в ходе электрофореза, а также посредством диффузии, обогащаются антителами, н, когда соотношение антигенов и антител достигает точки эквивалентности, они осаждаются в форме ииков. [c.102]

В качестве последнего примера белков, связывающих малые молекулы, уместно рассмотреть лектины. Эти белки, чаще всего встречающиеся в растениях (но не только в них), связывают производные углеводов со значительной степенью стереоспецифичности. Впервые лектины привлекли внимание исследователей своей способностью агглютинировать эритроциты посредством связывания гликопротеинов мембран. Некоторые лектины специфичны к индивидуальным групповым веществам крови. Интерес к ним увеличился после того, как было обнаружено, что некоторые из лек-тинов агглютинируют преимущественно злокачественные клетки. Посредством иммобилизации на нерастворимом носителе типа агарозы лектины могут быть использованы для очистки гликопротеинов методом афинной хроматографии. Наиболее изученным лек-тином является конкавалин А для этого белка определены аминокислотная последовательность из 238 остатков и трехмерная структура. Конформация конкавалина А весьма примечательна. Семь участков его единственной полипептидной цепи формируют антипараллельную складчатую структуру, а шесть последующих участков образуют другую антипараллельную структуру, перпендикулярную первой. Ион Mn + координирован с двумя молекулами воды и боковыми радикалами Н18-24, 01и-8, Азр-Ш и Азр-14, образуя октаэдр. Ион Са +, расположенный на расстоянии 0,5 нм от Мп +, делит с ним два последних лиганда, а также связан с карбонильным кислородом Туг-12, боковым радикалом Айп-14 и двумя молекулами воды и также образует октаэдрическую конфигурацию. Остатки глюкозы и маннозы связываются в глубоком кармане размером 0,6 X 0,75 X 1,8 нм, образованным, как это ни удивительно, гидрофобными остатками. [c.562]

Получают по р-ции 2,2,2-трифторо-этансульфонилхлорида (трезилхло-рида) с агарозой. Активированный гель уст. на хол. в течение ночи при pH 7,5, несколько нед. в I мМ H I. Активированный гель реагирует с сульфгидрильными гр., а также с аминогр. с образованием уст. связей. [c.447]

Эффективны в разделении белков на основе гидрофобных взаимодействий. Агарозы с присоединенными диаминоалканами агароза NH( H2) NH2 также могут быть использ. как сорбенты для гидрофобной хроматографии. [c.452]

В/см. В ходе электрофореза белковые фракции диффундируют из полоски в гель, содержащий антитела. Мигрируя в нем под действием электрического поля, они образуют преципитационные пики в результате специфической реакции с соответствующими антителами. Контуры преципитационных пиков формируются благодаря электрофоретической миграции антигена, а также постепенному уменьшению его избытка в результате этой миграции в геле агарозы. (Известно, что избыток антигена растворяет иммунные преципитаты, поэтому полосы преципитации образуются только там, где избыток антигена исчезает благодаря электрофоретической миграции.) [c.156]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология