Высаливание ферментов

Способностью высаливаться из растворов обладают очень многие вещества, в том числе и белки. Высаливание зависит от того, насколько растворитель замещен солью, так как этим обусловливается ослабление взаимодействия между растворителем и растворенным веществом. Можно также рассматривать явление высаливания как результат снижения активности воды под влиянием соли. Основными переменными величинами, определяющими растворимость белков, являются температура, pH и характер применяемого электролита. Наименьшую растворимость белки (ферменты) имеют при изоэлектрической точке. [c.147]

Малоселективными являются классические методы высаливания белков, когда растворимость белка понижается путем добавления соли, чаще всего сульфата аммония, в результате чего начинается выпадение белка из раствора. Так как растворимость различных белков зависит от концентрации соли несколько по-разному, то с помощью сульфата аммония производится частичное фракционирование белковых смесей. Когда-то это был почти единственный известный прием разделения белковых смесей. Он требовал бесчисленного повторения процедуры высаливания белка солями. Первые производства чистых белковых препаратов, например белков кровяной сыворотки или чистых протеолитических ферментов, нашедших значительные применения в медицине, были целиком основаны на высаливании белков солями. Одна пз трудностей этой технологии заключалась в необходимости избавляться от больших количеств прибавленных солей путем диализа. Поэтому в дальнейшем было предложено заменить осаждение белков солями осаждением с помощью органических жидкостей — спирта и ацетона. От последних можно избавиться путем испарения, что [c.132]

Для очистки ферментов применяют осаждение их из водных растворов органическими растворителями такими, как метиловый, этиловый, изопропиловый спирты, ацетон высаливание сульфатами аммония, натрия, цинка, хлоридом натрия фракционирование. Высушивание предварительно очищенных и сконцентрированных препаратов осуществляют в распылительных сушилках или методом сублимации. [c.89]

Огромное количество работ по очистке и фракционированию ферментов выполнено с применением сульфата аммония, который чрезвычайно эффективен в качестве осаждающего агента и в первую очередь вследствие своей хорошей растворимости, которая к тому же мало изменяется нри снижении температуры. Соль не только не оказывает денатурирующего действия на ферментные белки, но, наоборот, стабилизирует большинство из них. Поэтому при ее использовании нет надобности вести фракционирование системы при низкой температуре. Даже самые чистые препараты сульфата аммония имеют слабокислую реакцию и во всех случаях при использовании его необходим тщательный контроль pH в растворах. Обычно для того чтобы не увеличивать объемов при высаливаниях, вводят сухую соль или пользуются наиболее концентрированными, насыщенными растворами ее. Характеризуя концентрацию сульфата аммония при осаждении ферментных белков, ее часто выражают десятичной дробью, считая полное насыщение за 1,00. Иногда ту же величину показывают [c.147]

Самнер и Нортроп, применив высаливание ферментов сернокислым аммонием, спиртом или ацетоном, получили ряд ферментов в химически чистой кристаллической форме в количестве многих десятков и даже сотен граммов. [c.121]

ОЧИСТКА ФЕРМЕНТОВ ВЫСАЛИВАНИЕМ [c.127]

Так как для высаливания ферментов чаще всего применяют сернокислый аммоний, считаем нужным привести данные растворимости этой соли при различной температуре (табл. 26). [c.136]

Выделять ферменты в чистом виде довольно трудно. Известно несколько методов выделения ферментов, основанных на экстрагировании их из микроорганизмов водой или глицерином, на извлечении путем изменения pH среды под влиянием растворов нейтральных солей (метод высаливания), на осаждении различными органическими растворителями (ацетон, спирт) и др. [c.520]

Первые попытки разделения белков плазмы были основаны на фракционном осаждении их сульфатом аммония или спиртом. Фибриноген легко может быть получен методом высаливания. Электрофоретический анализ кровяной сыворотки показывает наличие в ней четырех основных фракций, названных альбумином и а-, р- и Y- Глoбyл и нa-ми. С улучшением техники разделения было показано, что эти фракции являются не индивидуальными белками, а группами белков, обладающими одинаковылш подвижностями. Дальнейшие успехи, достигнутые в период второй мировой войны Коном и Эдсоллом , были стимулированы большим спросом на пла шу, необходимую для предотвращения шока, зависящего от поддержания осмотического давления белками сыворотки. Цельная плазма содержит протеолитические ферменты, которые в большой мере расщепляют белки плазмы, поэтому получение белковой фракции крови в сухом виде сулило большие преимущества. [c.670]

Получаемый автолизах (не разбавленный водою) содержит фермент в высокой концентрации. Это позволило исключить из производства, например медицинского пепсина, этапы, направленные на повышение концентрации ферментного белка — ваку-ум-выпаривание или высаливание. [c.206]

Высаливание. При добавлении растворов солей щелочных и щелочноземельных металлов происходит осаждение белков из раствора. Обычно белок не теряет способности растворяться вновь в воде после удаления солей методами диализа или гельхроматографии. Высаливанием белков обычно пользуются в клинической практике при анализе белков сыворотки крови и других биологических жидкостей, а также в препаративной энзимологии для предварительного осаждения и удаления балластных белков или выделения исследуемого фермента. Различные белки высаливаются из растворов при разных концентрациях нейтральных растворов сульфата аммония. Поэтому метод нашел широкое применение в клинике для разделения глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении) и альбуминов (выпадают при 100% насыщении). [c.26]

Для растворенных веществ несложной структуры можно ожидать изменений в проявляемой ими тенденции удаляться из раствора или изменений коэффициентов активности под действием одновременно присутствующих в растворе веществ, влияющих на их растворимость летучесть и реакционную способность. Взаимодействия между макромолекулами в растворе, напротив, часто обратимо (и необратимо) влияют на структуру, что проявляется, например, в утрате активности при денатурации ферментов и изменениях точек плавления гелей. В равновесии кроме твердой фазы могут участвовать следующие типы частиц в растворе нативные макромолекулы, олигомерные или полимерные агрегаты, денатурированные макромолекулы. На рис. 1. 19 показаны структурные соотношения между этими типами частиц. К, е-т к пониманию наблюдаемого влияния солей и других растворенных веществ па эти равновесия состоит в том, что в каждом из состояний, изображенных на рис. 1.19, для растворителя доступны в различной степени те или иные группы молекул [253, 287, 351]. Хорошо известно, что конформации, которые макромолекулы,принимают в растворе, определяются стремлением к сближению всех гидрофобных групп между собой и к обеспечению доступа растворителя к гидрофильным группам [338]. В целом степень доступности молекулы для растворителя возрастает в ряду твердый белок < агрегированный или полимерный белок < нативный мономерный белок < денатурированный белок [287]. Однако, по-видимому, в каждом из этих случаев для растворителя оказываются доступными различные совокупности полярных и неполярных групп, причем степень доступности и состав групп зависят от природы макромолекулы. Влияние растворенных веществ на денатурацию, высаливание, деполимеризацию и т.д. можно объяснить, если учесть взаимодействия разных индивидуальных групп (заряженных, неполярных, полярных) [2871. [c.138]

ОЧИСТКА ФЕРМЕНТОВ ВЫСАЛИВАНИЕМ. ОСАЖДЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ НЕЙТРАЛЬНЫМИ СОЛЯМИ И ДРУГИМИ ВОДООТНИМАЮЩИМИ СРЕДСТВАМИ [c.134]

Принцип метода. Методы выделения амилаз из покоящихся и проросших семян основаны на настаивании размолотых семян с водой или слабым раствором нейтральных солей. При этом большая часть амилаз переходит в вытяжку. Очищают ферменты чаще всего высаливанием из растворов сульфатом аммония. Раздельное количественное определение активности амилаз основано на различной термолабильности а- и -амилаз. -амилаза разрушается нагреванием до 70°, при этом а-амилаза сохраняет свою активность. Некоторое снижение активности а-амилазы, которое может быть в таких условиях, практического значения не имеет. [c.149]

Это выполняется чаще всего осаждением вытяжки спиртом (этиловым, изопропиловым), но возможны, естественно, и иные способы выделения ферментов из нее, например высаливанием. При осаждении спиртом необходимо вытяжку и спирт предварительно охлаждать (до 5°С), чтобы избегнуть инактивации ферментных белков. Кроме того, при этом способе нужно систематически регенерировать значительные количества спирта, что не представляет сложной задачи. Потери при регенерации составляют 1—2%. [c.176]

При реакциях осаждения белок выпадает в осадок или необратимо (свертывание) или обратимо (высаливание). Так, например, из водных растворов белки высаливаются солями легких металлов — сернокислым магнием, хлористым натрием, сернокислым аммонием здесь процесс обратим при разбавлении водой белок снова переходит в раствор. При действии же солей тяжелых металлов (железа, свинца, меди, ртути) белки осаждаются необратимо и достаточно полно. Также необратимо осаждают белки таннин, пикриновая кислота, фосфорномолибденовая и фосфорновольфрамовая кислоты, азотная кислота. Большинство белков свертывается при нагревании с водой (например, белок куриного яйца), а также при действии спирта. Температура свертывания для разных белков различна и характерна, что служит иногда их отличительным признаком. Свертываются белки и при действии ферментов так, например, белок молока [c.339]

Теория фракционирования ферментов высаливанием в своей основе выражается уравнением [c.147]

Обычно считают нецелесообразным повторять фракционирование сульфатом аммония в одинаковых условиях несколько раз подряд. Но если варьировать температуру или pH, то порядок, в котором будут осаждаться различные белки, может измениться. В таком случае целесообразно проводить фракционирование последовательно, при разных условиях. Иногда для разделения системы используют различные соли последовательно или в виде смеси. Так, известен метод, в котором обезжиренную муку земляного ореха экстрагировали 10%-ным хлористым натрием при рН = —6,0, а затем из осветленного экстракта белки фракционировали с помощью сульфата аммония. Чтобы выделять отдельные ферменты, солевое разделение можно использовать и само по себе, и в комбинации с иными способами, с воздействиями, основанными на иных принципах. Сочетаются, например, высаливание, адсорбционные способы и электрофорез, спиртовое разделение фракций и затем их солевая очистка, дробное высаливание и электрофорез и т. п. [c.148]

В начале, по-видимому, всегда целесообразно отделить заметную часть балластных белков путем фракционной денатурации прогреванием или осаждением в слабокислой среде. Наоборот, кристаллизацию выгоднее проводить на заключительных этапах очистки. Основными операциями, выполняемыми на средних стадиях, являются фракционирование органическими растворителями, нейтральными солями, адсорбцией или хроматографическим разделением на колонках, в том числе с применением ионообменников. Очень важно, по возможности, чередовать этапы таким образом, чтобы избежать операции диализа. Так, высаливание, удобное в качестве первого этапа, требует диализа, но фракционирование спиртом позволяет его избежать. Простого прибора для быстрого диализа больших объемов жидкостей пока еще не существует можно полагать, что из всех способов очистки диализ — самый медленный и неудобный. Его легче проводить в заключительных стадиях, когда вещества уже мало и объемы невелики. Во время диализа возможны значительные потери активности фермента. С большими объемами жидкостей неудобно работать и в колонках последние лучше использовать [c.155]

Молекулярная сорбция некоторых ферментов определенными ионитами может быть резко повышена за счет процесса высаливания (адсорбция высаливанием), что, как будет показано ниже, проявляется при сорбции амилазы силикагелем и крахмалом. [c.86]

Разработаны оптимальные условия и принципиальные технологические схемы сорбции амилазы из культуральной жидкости силикагелем в динамических и статических условиях. Приведен механизм сорбции ферментов ионитами. Показано, что сорбция может протекать за счет поверхностно-молекулярного взаимодействия без ионного обмена, а также за счет сил Ван-дер-Ваальса в сочетании с ионообменным процессом и путем так называемой сорбции высаливанием (силикагель, крахмал). Возможна также сорбция ферментов способом гель-фильтрации с одновременным взаимодействием с матрицей молекулярного сита (сефадекс А-50). [c.116]

Очистка препарата тяжелого меромиозина осаждением сернокислым аммонием. Наиболее простым способом очистки служит высаливание фермента сернокислым аммонием. При этом собирают фракцию, выпадающую между 40—60% насыщения Следует, однако, соблюдать два условия во-первых, использовать сернокислый аммоний, перекристаллизованный с ЭДТА, так как даже следовые количества ионов магния, прочно связываясь с ТММ, ингибируют активность, и, во-вторых, перед добавлением к раствору фермента раствора насыщенного сернокислого аммония необходимо проконтролировать pH последнего и в случае необходимости довести его до нейтрального или слабощелочного. Выпавший в осадок тяжелый меромиозин отделяют центрифугированием, растворяют в небольшом объеме (3—6 мл) бидистиллята и диализуют при О—4 °С в течение ночи против 1 л бидистиллированной воды, чтобы освободиться от сернокислого аммония. Внешний раствор несколько раз меняют и проводят контроль на присутствие в нем ионов 5042- с помощью насыщенного раствора хлористого бария. В диализном мешочке может вновь выпасть осадок, который следует отцентрифугировать и отбросить. В надосадочной жидкости одним из общепринятых методов определяют содержание белка, которое обычно составляет 1—10 мг/мл. [c.395]

ПЕПСИН (греч. рер518 — пищеварение) — фермент желудочного сока, расщепляет белки до пептидов. Молекула П. представляет собой полипептидную Цепь примерно из 340 аминокислотных остатков. П. получают высаливанием из автолизатов слизистой оболочки желудка. П. применяется в сыроварении, при лечении некоторых заболеваний желудочно-кишечного тракта. [c.187]

При реакциях осаждения белок вьшадает в осадок или необратимо (свертывание), или обратимо высаливание). Так, нйпример, из водных растворов белки высаливаются солями легких металлов — сернокислым магнием, хлористым натрием, сернокислым аммонием здесь процесс обратим при разбавлении водой белок снова переходит в раствор. При действии же солей тяжелых металлов (железа, свинца, меди, ртути) белки осаждаются необратимо и достаточно полно. Также необратимо осаждают белки таннин, пикриновая кислота, фосфорномолибденовая и фосфорновольфрамовая кислоты, азотная кислота. Большинство белков свертывается при нагревании с водой (например, белок куриного яйца), а также при действии спирта. Температура свертывания для разных белков различна и характерна, что служит иногда их отличительным признаком. Свертываются белки и при действии ферментов так, например, белок молока — казеин — свертывается при прибавлении сычужного фермента (добываемого из телячьего желудка) кровь, выпущенная из сосудов, свертывается под влиянием фермеН тов, появляющихся Б самой крови, и т. п. [c.337]

Хорошие результаты дает использование сульфат-изопропило-вого способа выделения целлюлазы из культуральной жидкости. В качестве оптимальных условии выделения целлюлолитических ферментов можно считать следующие температура 4—15°С, исходный pH культуральной жидкости 7—8, длительность высаливания сульфатом аммония 12—16 ч, концентрация изопропанола 10%. При этом выход фермента по активности достигает 75— 80%, а активность полученного ферментного препарата составляет 1 — 1000 Сз — ИЗО и Сж — 3900 ед./г. Лучшим методом сушки, обеспечивающим максимальную стабильность препарата является лиофильная или вакуумная сушка при относительно низкой температуре. [c.201]

В любом случае полз чение экзо- и эндоферментов на определенных этапах как бы унифицируется, когда все стадии выделения и очистки будут определяться лишь их физико-химическими характеристиками Так, при выделении экзофермента клетки продуцента становятся отходом, а культуральная жидкость или, в другом случае, желудочный сок - целевым продуктом-сырцом Если речь идет о необходимости получения эндоферментов, то содержащие их клетки и ткани измельчают (дезинтегрируют) и экстрагируют подходящим растворителем Полученный раствор также представляет собой полупродукт — сырец И если речь здесь идет об одном и том же ферменте, но разного происхождения и топологии (экзо-и эндо-), то, начиная с сырца, технологические схемы их выделенйя будут во многом тождественными В этом случае можно использовать такие подходы, как высаливание, сепарирование в градиентах плотности каких-либо веществ, мембранную фильтрацию, гель-хроматографию, афинную хроматографию, ионный обмен и дру- [c.48]

Осаждение широко используют в микробиотехнологии при получении белков (например, ферментов), полисахаридов, ряда антибиотиков и других веществ. Белки выделяют при высаливании, изменении pH до изоэлектрической точки, снижении диэлектрической проницаемости раствора, снижении степени сальватахщи белковых молекул, и другими процедурами. [c.389]

Белок, осажденный высаливанием, можно отделить от белков, оставшихся в растворе, центрифугированием или фильтрованием и вновь растворить, добавив воду или буферный раствор. Этим методом можно концентрировать растворы (после осаждения раст1ворить белок в меньшем объеме растворителя). Метод высаливания белков широко используется в научно-исследовательских лабораториях при выделении и очистке различных белков (ферменты, гормоны и др.) и в производственных условиях для получения белковых препаратов (лечебные сыворотки, кристалличеекиёОелки и др.). [c.24]

Высаливание белков концентрированными растворами ЫагЗО или (NH4)2S04 применяется при выделении ферментов из экстрактов тканей и является одним из методов фракционирования белковых смесей на альбумины и глобулины. Растворимость белков уменьшается также при добавлении дегидратирующих веществ (спирта, ацетона). [c.114]

Гормон паращитовидных желез экстрагируется из ткани этих желез разведенной соляной кислотой. Перешедшие в раствор белковые примеси осаждаются при доведении реакции экстракта до изоэлектрической точки (pH 5), после чего производится высаливание гормона при той же самой реакции среды [121]. Из кислого экстракта гормон можно осаждать также и при помощи ацетона [122]. Он не денатурируется разбавленной горячей соляной кислотой. За единицу гормона принимают такое его количество, которое повышает уровень кальция в крови собаки весом 10 кг на 1 мг% за 16 час. Чистые препараты гормона содержат приблизительно 300 единиц на 1 мг азота. Гормон паращитовид-ной железы, повидимому, расщепляется протеолитическими ферментами. На это указывает отсутствие активности гормона при введении его рег оз. [c.323]

При выделении ферментов и других белков часто пользуются высаливанием при помощи сульфатов. Для дальнейшей очистки от солей раствор белка подвергают длительному диализу, что иногда приводит к денатурации. Очень удобным методом отделения белков от солей является фильтрация через декстрановый гель. [c.132]

Первым ферментом, выделенным в чистом кристаллическом виде, была уреаза (Ж. Б. Сумнер, 1926 г.). Она была получена из одной разновидности фасоли экстрагированием водой и осаждением экстракта ацетоном. Затем были выделены в кристаллическом виде высаливанием из водных растворов сернокислым аммонием или сернокислым магнием при определенном pH пепсин и трипсин (И. X. Норсроп и М. Куниц, 1929 г.), а также и другие ферменты, в том числе желтый окислительный фермент, папаин, карбоксипептидаза, тирозиназа, каталаза и несколько дегидраз. [c.793]

Физико-химические свойства ферментов обусловлены их белковой природой. Ферменты не диализируют сквозь полупроницаемые мембраны, способны высаливаться и дают характерные для белка цветные реакции и реакции осаждения. При выделении ферментов методами высаливания, фракцио-нировйния ацетоном и колоночной хроматографии они не теряют каталитических свойств, что позволяет выделять активные ферментные препараты для практических целей (пепсин, трипсин, амилаза, липаза и др.). [c.99]

Решающую роль в работах по очистке ферментов от сопутствующих примесей сыграли, как уже указывалось, исследования Самнера и Норт-ропа, применивших для получения ферментов в химически чистом виде метод высаливания белковых веществ нейтральными солями щелочных металлов и другими водоотнимающими средствами. Успешная разработка именно этих последних методов очистки позволила получить, ряд ферментов в форме своеобразных кристаллов (стр. 121). [c.127]

Кристаллизация пепсина. Исходным материалом для производства кристаллического пепсина является высокоактивный препарат фермента, получаемый, как описано в операции 4 (активность 1 10 000). Можно применять как сухой препарат, так и сырой, отжатый высол , получаемый в операции 3 и содержащий около 50% влаги. Соответственно сухого препарата берут вдвое меньше, но прибавляют к нему равное по весу количество воды. Возможно также использовать сывороточный пепсин (см. операцию 5), но в этом случае необходимы предварительные операции растворения препарата и высаливания из него белка. [c.204]

Далее, на колонке аналогичной смолы, но уже с низкой степенью сшивки, адсорбируют фермент. Для этого лучше всего применять Какен С-1 (SP-3) , но можно и дуолит С-10 или S-30. Ферментный белок затем очищают вытеснительной хроматографией, высаливанием сульфатом аммония и осаждением ацетоном, после чего, в случае надобности, кристаллизуют. Выход фермента по активности 5—15%. Он расщепляет в казеине — 75% пептидных связей, в клейковине пшеницы —80%, а в яичном альбумине— 87%. Большое значение для стабильности протеазы имеет присутствие в растворах иона Са, обычно прибавляемого в виде Са-ацетата. [c.208]

Высокоочищенная глюкоамилаза получилась после фракционного осаждения этанолом и последующего отделения транс-гликозилазы на ДЭАЭ-целлюлозе. После диализа проводится высаливание сернокислым аммонием, затем снова диализ и осаждение ферментов ацетоном. [c.76]

В промьшшенности для вьщеления ферментов применяют методы, основанные на изменении растворимости фермента в системе. Наиболее широко используется метод высаливания нейтральными солями либо осаждение органическими растворителями, чаще всего пepвичньпvlи спиртами. Недостатки перечисленных методов — загрязнение сточных вод солями, пожароопасность производства - стимулируют разработку более эффективных и менее опасных способов выделения ферментов. Одним из таких путей представляется использование флокулянтов. [c.130]