Концентрация раствора фермента

Разновидность количественной аффинной хроматографии — фронтальный анализ [10] он основан на понятии плотности о аффинного лиганда на единицу длины колонки с агарозой. Если / — общая длина колонки с агарозой, а Li — общее количество им мобилизованного лиганда в сорбенте, то о = - г/ - Если аффинный сорбент характеризуется слабым сродством, то раствор фермента в концентрации [ 0] наносится на колонку непрерывно, а для элюирования фермента с колонки необходим объем V. Можно написать следующее уравнение [c.51]

По своему физическому смыслу константа ингибирования численно равна концентрации ингибитора, при содержании которой в растворе концентрация активного фермента уменьшается вдвое, т. е. (ЕН]=2 [ЕН](1) при [I] В этом случае из выражений [c.246]

В работе [163] исследовалась тепловая инактивация трипсина при разных температурах (37—50° С). Для изучения влияния углеводородов на тепловую инактивацию трипсина растворы фермента предварительно насыщались углеводородами при 4° С. Чтобы обеспечить максимальную концентрацию углеводорода в водном растворе трипсина при каждой температуре растворы выдерживались под слоем углеводорода. [c.32]

Исходя из определения единицы количества фермента, можно в значениях единицы выразить ряд производных величин удельную и молекулярную активностЬ активность каталитического центра, концентрацию раствора фермента. [c.104]

Ц. получен с высоким выходом реакцией хлорангидрида коричной кислоты с имидазолом в бензоле при 10—25° [1]. Ц. быстро и количественно реагирует с активным центром а-химотрипсина, поэтому его можно использовать для спектрофотометрического определения концентрации раствора фермента титрованием. [c.227]

Из уравнения (8.41) можно рассчитать время, необходимое для завершения каждого последующего реакционного цикла (до 99%-ной степени превращения субстрата, т. е. до образования 0,99М продукта) при данной исходной концентрации активного фермента. Так, время необходимое для завершения первого реакционного цикла (при начальной концентрации активного фермента, равной 3-10 М), равно 10,3 часа при этом концентрация активного фермента после завершения цикла составит 69% от первоначальной. Для завершения второго цикла потребуется 16,3 часа, после которых концентрация активного фермента составит 38% первоначальной. Третий реакционный цикл пройдет за 45,5 часов, и концентрация активного фермента к окончанию цикла понизится до 6,7% от исходной. Практически полная инактивация фермента должна произойти во время четвертого цикла реакции. Таким образом, за 72 часа непрерывной работы реактора можно осуществить три полных реакционных цикла и получить при этом 300 л раствора 6-АПК концентрации 0,99 М. При количественном выделении продукта выход 6-АПК составит 297 молей или 64,5 кг. [c.184]

Например, если полная концентрация фермента в растворе равна во, а концентрация субстрата 5 > ео, то концентрация комплекса фермент — субстрат согласно (14.41) запишется в виде [c.229]

Проценты употребляются для выражения концентрации растворов, отнощения массы отдельного компонента к общей массе смеси и др. Промилле, миллиграмм- и микрограмм-проценты употребляются в тех случаях, когда концентрация компонента в объекте очень мала, например концентрация ферментов, гормонов, витаминов, микроэлементов в тканях организмов, в лекарственных препаратах и т. п. [c.9]

Рассмотрим реагенты, которые составляют субстрат 8 биологической реакции, катализируемой ферментом Е с образованием продуктов Р. Начальные растворы ферментов и субстратов разбавлены исследуем влияние изменения концентрации субстрата на скорость реакции. [c.152]

Скорости и соответственно токи электрохимического восстановления кислорода в определенном интервале концентраций и потенциалов линейно зависят от поверхностной концентрации иммобилизованного фермента. Линейная связь между скоростью реакции и концентрацией фермента наблюдается в интервале 0,6—1,2 В, определенному по водородному электроду в том же растворе. В области этих потенциалов лимитирующей является ферментативная реакция. [c.85]

Скорость реакции, катализируемой ферментом, как правило, оказывается прямо пропорциональной концентрации фермента. Если изменять концентрацию субстрата, то обычно при низких его концентрациях реакция имеет первый порядок по субстрату, а по мере увеличения концентрации субстрата порядок реакции приближается к нулевому (рис. 10.10,а). Фактически измеряемые скорости суммарной реакции являются скоростями, относящимися к стационарному течению реакции. Когда смешиваются растворы фермента и субстрата, вначале происходит очень быстрая реакция фермента с субстратом, скорость которой можно измерить только с помощью специальных методов (например, релаксационных методов, разд. 10.2). Механизм стационарной реакции можно понять, если рассмотреть следующую простейшую схему реакции, описываемой суммарным уравнением 5 = Р [c.320]

Э. Гриффин, 1916), но и сейчас не потеряла своего значения и стала наиболее широко распространенным способом получения иммобилизованных ферментов в промышленности. В литературе описано получение адсорбционным способом более 70 иммобилизованных ферментов с использованием главным образом таких носителей, как кремнезем, активированный уголь, графитов сажа, различные глины, пористое стекло, полисахариды, синтетические полимеры, оксиды алюминия, титана и других металлов. Последние применяются наиболее часто. Эффективность адсорбции молекулы белка на носителе определяется удельной поверхностью (плотностью центров сорбции) и пористостью носителя. Процесс адсорбции ферментов на нерастворимых носителях отличается крайней простотой и достигается при контакте водного раствора фермента с носителем (статистическим способом, при перемешивании, динамическим способом с использованием колонок). С этой целью раствор фермента смешивают со свежим осадком, например, гидроксида титана, и высушивают в мягких условиях. Активность фермента при таком варианте иммобилизации сохраняется практически на 100%, а удельная концентрация белка достигает 64 мг на 1 г носителя. [c.88]

Определение. Навеску субстрата (из расчета 10 мг/мл реакционной смеси) помещают в термостатируемую при 40 С пробирку, приливают 15 мл 0,1 М ацетатного буфера (pH 4,5) и перемешивают на магнитной мешалке 5 мин. Затем в пробирку добавляют 5 мл раствора фермента. Через определенные промежутки времени (5-20 мин) отбирают пробы объемом 5 мл, фильтруют и определяют оптическую плотность при 490 нм. Концентрацию фермента подбирают таким образом, чтобы оптическая плотность в последней пробе не превышала 0,7-0,9. Измерения проводят относительно контрольной пробы, которую готовят аналогично опытной, но вместо ферментного раствора используют ацетатный буфер. [c.150]

М растворе Na l (4—4,5 мл) и растворяют путем осторожного добавления 0,1 н. раствора NaOH. В связи с тем что карбоксипептидазы А и В являются металлоферментами, в ряде методик рекомендуют добавлять к раствору фермента, полученному по выщеуказанному способу, 0,5 мл 0,1 н. раствора 0 I2 и выдерживать раствор при 25°С в течение 10 мин. Концентрацию фермента можно определить, измерив оптическую плотность раствора при 278 нм (коэффициент молярной экстинкции 8,6-10 , м.м. = 34300). Полученный препарат фермента хранят в холодильнике. [c.155]

Для того чтобы из уравнения (3.2) вывести другие зависимости, Грейвс и Ву [3] сделали следующие допущения. Объем геля V включает меньший объем V раствора внутри сетки, построенной полимерными молекулами геля. Перед добавлением раствора фермента концентрация аффинного лиганда, связанного в геле, равна 0 (в молях на объем и), а концентрация фермента равна [c.22]

Ео — начальная концентрация фермента в фазе раствора перед контактом с фазой геля [ЕЕ] —равновесная концентрация комплекса фермент — лиганд [c.35]

Концентрацию растворов фермента определяют на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 280 нм с использованием коэффициента молярной экстинкции 1,96-10 л (моль" см -) для мышечной и 0,196 10 л (моль -см О для сердечной изоформы. [c.268]

В последнее время работами Хесса с сотрудниками [5—7] на примере а-химотрипсина был развит новый метод изучения кинетики начальных стадий ферментативных реакций, получивший название метода вытеснения профлавина . Метод основан на том факте, что краситель профлавин (3,6-диаминоакридин) при связывании с а-химотрипсином в водном растворе изменяет свой спектр поглощения в ультрафиолетовой области. Величина разностного спектра поглощения, имеющего максимальное значение при длине волны 465 нм, пропорциональна -концентрации комплекса фермент-профлавин. Введение в систему фермент-профлавин субстрата, конкурирующего с красителем за связывание на активном центре а-химотрипсина, приводит к двум последовательным процессам вытеснения профлавина. Первый, очень быстрый процесс, заключается в обратимом вытеснении красителя из комплекса его с ферментом за счет образования нековалентного фермент-субстратного комплекса. Второй процесс, времена прохождения которого лежат обычно в пределах разрешения установок типа остановленной струи , вызван химическим взаимодействием субстрата с ферментом (например, образованием ацилферментного промежуточного соединения), что приводит к дополнительному уменьшению концентрации комплекса фермент-профлавин. Изучение кинетики второго процесса при различных концентрациях субстрата в дополнение к изучению кинетики ферментативной реакции в стационарном режиме позволяет сделать заключения о стадийности изучаемой реакции, а также найти значения констант скоростей промежуточных стадий ферментативной реакции. [c.188]

Кинетику гидропиза этилового эфира Ы-ацетил-Ь-трипто-фана, катализируемого а-химотрипоином, изучали в начальный период реакции с помощью метода вытеснения профлавина [5]. Было найдено, что уменьшение оптической плотности раствора во времени, соответствующее уменьшению концентрации комплекса фермент-профлавин, описывается кинетикой первого порядка с эф- [c.195]

Кинетику гидролиза м-нитрофенилового эфира Ы-ацетил-Ь-тр птофана, катализируемого а-химотрипсином, изучали методом остановленной струи по вытеснению профлавина из комплекса фермент-профлавин в начальный период реакции (в условиях 8 [Е]о). Уменьшение оптической плотности раствора при длине волны 480 нм (соответствующей уменьшению концентрации комплекса фермент-краситель) описывалось кинетикой первого порядка (табл. 13). Из независимых экспериментов было найдено, [c.198]

Перспективно применение фермента — глюкозо-изомеразы в крахмало-паточной промышленности. Одним из продуктов, выпускаемых этой промышленностью, является глюкоза, которую получают гидро- . лизом (кислотным или ферментативным) крахмала. Однако глюкоза не очень сладкая, при равной концентрации растворов она почти в два раза менее сладкая, чем сахароза. Глюкозоизомераза может превращать часть глюкозы в растворе во фруктозу — значительно более сладкий сахар, чем сахароза. В результате получается жидкий сироп, состоящий из глюкозы и фруктозы, по сладости не уступающий сахарному сиропу такой же концентрации. [c.113]

Кристаллизация. Раствор белка охлаждают (можно использовать охлаждающую смесь Na l со льдом). К охлажденному до 0° С раствору добавляют АМФ и Mg (СНзСООН) 2 до конечной концентрации, соответственно равной 0,001 и 0,01 М. Кристаллизация фосфорилазы b начинается через 15—20 мин (иногда через 1—2 ч). Для более полной кристаллизации раствор фермента оставляют на ночь при О—4° С. На следующий день суспензию центрифугируют (15000 , 5—20 мин лри О—4° С), осадок растворяют в 30 мМ Na-p-глицерофосфате, pH 6,8, содержащем 30 мМ L-цистеин (или 2-меркаптоэтанол) при 30° С. Нерастворившийся белок отделяют центрифугированием и отбрасывают. К супернатанту вновь добавляют АМФ и Mg (СНзСООН) 2 в той же концентрации. [c.222]

В спектрофотометрическую кювету помещают 0,05 М пирофосфатный буфер pH 9,0 (2,5 мл), гидразин (конечная концентрация — 20 мМ), глицерол-З-фосфат (конечная концентрация — 1,8 мМ), НАД+ (конечная концентрация — 1,2 мМ), Объем пробы доводят до 3 мл. Реакцию начинают добавлением 30—50 мкл раствора фермента. Измеряют нарастание поглощения при 340 нм. Определение белка проводят спектрофотометрически, учитывая, что при 280 нм Лп м=7,4. [c.267]

Растворы ферментов готовят непос едственно перед проведением иммобилизации суспензию фермента в сульфате аммония растворяют в буфере А (предпочтительно отцентрифугировать кристаллы фермента и их растворить в буфере А), затем обессоливают на колонке с сефадексом С-25 или 0-50, уравновешенным тем же буфером. Оптимальная концентрация фермента — около 1 мг/мл. Повышение концентрации [c.297]

К активированной сефарозе добавляют равный объем раствора фермента (1 мл на 1 г сефарозы) и инкубируют при комнатной температуре в течение 2,5—3,0 ч при перемешивании. К суспензии добавляют сухой глицин до конечной концентрации 50 мМ и оставляют при перемещивании в холодной комнате на ночь. Сефарозу отмывают в колонке или на стеклянном фильтре буфером А от неспецифически адсорбировавшегося белка и глицина до исчезновения в элюате поглощения при 280 нм и прекращения активности фермента. [c.298]

Окисление пероксидазы. Растворяют 5—10 мг пероксидазы в I мл дистиллированной воды при легком перемешивании до конечной концентрации 5 мг/мл. Концентрацию определяют по формуле Л4оз-0,44Л, где X — фактор разведения, Л403 — оптическая плотность раствора при 403 нм. К раствору фермента добавляют 0,2 М водный раствор NaJ04 до конечной концентрации 0,016 М. При этом раствор пероксидазы должен изменить цвет от золотисто-коричневого до зеленого. Инкубируют в темноте при легком перемешивании в течение 20 мин. Процесс окисления останавливают добавлением этиленгликоля до конечной концентрации 0,16 М. Смесь инкубируют при тех же условиях в течение 1 ч и диализуют против 1000-кратного объема ацетатного буфера при 4°С в течение 18—24 ч. [c.317]

Реассоциация иммобилизованных димеров с растворимыми проводится следующим образом. К иммобилизованным димерам добавляют 1—2 объема раствора фермента в 0,1 М Ма-фосфатном буфере (pH 7,2), содержащем 5 мМ ЭДТА так, чтобы конечная концентрация фермента [c.385]

Перенос электронов по дыхательной цепи митохондрий завершает цитохромоксидаза (цитохром сЮг-оксидоредуктаза, комплекс IV), катализирующая реакцию восстановления молекулярного кислорода до воды. Донором электронов для фермента служит ферроцитохром с. Реакция специфически блокируется цианид- и азид-ионами, а также окисью углерода. Цитохромоксидаза прочно связана с внутренней мембраной митохондрий и является интегральным мембранным белком в раствор фермент может быть высвобожден лишь после растворения мембраны высокими концентрациями детергентов. В нативной мембране, а также в растворах неионных детергентов (тритон Х-100, твин-80, Emasol-1130) цитохромоксидаза присутствует в виде высокоактивного димера. Некоторые воздействия (рН>8,5, высокие концентрации солей и неионных детергентов) вызывают появление мономерных форм фермента. Каталитическая активность цитохромоксидазы зависит от степени агрегации молекулы фермента. [c.432]

В отсутствие электрического поля при пропускании раствора целлюлазного ферментного препарата через слой порошковой целлюлозы в рабочей камере установки на целлюлозе адсорбируется некоторое количество ферментов, определяемое их природными адсорбционными характеристиками. Через некоторое время адсорбция прекращается и концентрация ферментов на выходе из рабочей камеры приближается к концентрации на ее входе (рис. 3.9). При включении тока концентрация ферментов на выходе из рабочей камеры резко падает. При увеличении напряженности поля эффективность электроудерживания возрастает вплоть до предельного значения, когда все входящие в рабочую камеру ферменты удерживаются на цел цолозе и их концентрация на выходе из камеры равняется нулю (рис. 3.9). Максимальная эффективность электроудерживания наблюдается при достижении напряженности поля определенной пороговой величины, которая мало зависела от природы ферментного препарата, но была пропорциональна его концентрации в растворе на входе в рабочую камеру. Например, при концентрации раствора (по белку) 1 г/л пороговое значение напряженности поля составляет около 100 В/см. Без отключения тока десорбция ферментов не наблюдается, тогда как [c.88]

Взаимодействие аргинил- РНК-синтетазы из Е.соИ с субстратом аргинином, содержащим радиоактивную метку [ С]-аргинина, исследовали с использованием метода равновесного диализа. Диализ проводили в кювете, разделенной на два равных по объему отсека целлюлозной мембраной, проницаемой для а згинина и непроницаемой для фермента. В кювету запива.пи раствор субстрата различной концентрации в стандартном буфере. Далее в один из отсеков кюветы вносили раствор фермента в стандартном буфере. Концентрация фермента во всех опытах была постоянной, равной 6,5 мкМ. После проведения диализа и установления равновесия определяли концентрацию арпшина в отсеке, не содержащем фермент. [c.126]

При промьплленном производстве ферментов наряду с активностью важными показателями являются их термоустойчивость, pH и стабильность. Следует также учитывать, что увеличение концентрации неочищенных растворов ферментов может сопровождаться повышением содержания ингибирующих примесей до критического с одновременным разложением и удалением стабилизирующих про- [c.57]

АМР на сефарозе [4]. Связаны ли наблюдаемые различия в ходе этих кривых с различиями констант равновесия для образования индивидуальных комплексов, к сожалению, не известно автору этой книги однако, судя по концентрациям растворов хлорида калия, необходимых для элюирования каждого фермента с упомянутого нуклеотидного носителя, связывание глицерокиназы слабее лактатдегидрогеназ (табл. 4.2). [c.25]

Геометрия колонок, концентрация и общее содержание аффинного лиганда — вот три основных параметра, которые определяют и связываемость, и емкость носителя. Для систем с высокой аффинностью высота колонки с аффинным сорбентом, содержащим высокие концентрации лиганда, мало влияет связываемость зависит от концентрации аффинанта, а не от высоты колонки. Это имеет практическое значение колонки, содержащие высокие концентрации лиганда, можно использовать для концентрирования разбавленных растворов ферментов. Кроме того, в системах с высокой аффинностью, в которых элюирование адсорбированных макромолекул без денатурации затруднено, разбавление аффинного сорбента немодифицированным гелем или уменьшение концентрации лиганда может способствовать элюированию в более мягких условиях. В некоторых случаях, конечно, фермент различает только концентрацию лиганда в гранулах модифицированного геля, которая, однако, не меняется при разбавлении. В таких случаях трудности элюирования остаются даже после разбавления геля [11]. Для взаимодействий систем с низкой аффинностью очень важна геометрия колонки. Для разделения специфически адсорбированных белков от неадсорбированных наиболее выгодно использовать длинные колонки, а не короткие. [c.80]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология