АТФаза

Особое место среди них занимают ионные насосы (транспортные АТФазы) — белки, способные за счет энергии гидролиза АТФ переносить одно- и двухвалентные катионы (или анионы) через клеточные и внутриклеточные мембранные структуры против градиента концентрации. Так, Са-АТФаза саркоплазматического ретикулума (СР) регулирует процессы сокращения-расслабления в мышцах разных типов, аккумулируя Са2+ из цитоплазмы внутрь СР. [c.358]

Реактивы для определения активности Са—АТФазы. [c.363]

ИССЛЕДОВАНИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ СВОЙСТВ Са АТФазы [c.358]

АТФазы и Mg—АТФазы расчет энергии активации [c.364]

Миозин, будучи АТФазой, относится к числу так называемых энергопреобразующих ферментов, так как при его непосредственном участии осуществляется трансформация энергии химических связей в механическую работу. Для ферментов такого типа характерна тесная связь катализа с конформационными перестройками. За счет этога возможна регуляция активности фермента путем воздействия на группы, не входящие непосредственно в активный центр, а также при воздействии на него веществ, влияющих на конформацию белка. Совершенно очевидно, что субстрат (АТФ) должен в большинстве случаев оказывать защитное действие, стабилизируя структуру в области активного центра. [c.398]

При работе с мембранными препаратами Са—АТФазы СР целесообразно поставить следующие эксперименты [c.362]

Важным фактором, оказывающим влияние на гидролазную активность, является АДФ — продукт АТФазной и субстрат АТФ-синтетаз-ной реакции. В определенных концентрациях АДФ ингибирует гидролиз АТФ по простому конкурентному типу торможения. Действие АДФ очень специфично. Только АДФ является ингибитором гидролиза АТФ и других НТФ. Известны активаторы АТФазы, действие которых обусловлено снятием торможения, вызванного АДФ. К таким активаторам относится, например, сульфит-ион. [c.474]

Реакции- синтеза и гидролиза АТФ катализируются АТФ-синтетазным комплексом, локализованным во внутренней мембране митохондрий. Обе реакции сопряжены с трансмембранным переносом Н+. Н+—АТФаза митохондрий сердца быка состоит из фактора и мембранного компонента / о- Фактор Р может быть отделен от мембраны и катализировать гидролиз АТФ в растворе. Реакция синтеза АТФ, сопряженная с трансмембранным переносом Н+, протекает только в том случае, когда фактор Р связан с мембраной. Мембранный компонент АТФ-синтетазного комплекса образует протонный канал , обеспечивая транспорт Н+ с внешней стороны митохондриальной мембраны к фактору Р, где находится активный центр фермента. [c.474]

ФИТЦ — флуоресцентная метка, ковалентно модифицирующая аминогруппы белка. Максимум возбуждения ФИТЦ — 490—495 нм, максимум флуоресценции — 525 нм. Обработку препаратов Са—АТФазы данной флуоресцентной меткой проводят в среде, содержащей [c.366]

ООО, 37 ООО, 25 000, 21 ООО и некоторые другие. Большинство этих полос соответствует различным фрагментам тяжелых цепей. Следует обратить внимание на то, что, несмотря на наличие разрывов в полипептидных цепях, активность тяжелого меромиозина как АТФазы в полной мере сохраняется. АТФазную активность определяют так же, как и для миозина (с. 393). [c.392]

Анализ инактивации Са—АТФазы ретикулума НБД-хлоридом [c.362]

Здесь Е — Са—АТФаза, Ь — лиганд (АТФ или АДФ) /С д — кажущаяся константа диссоциации комплекса фермент — лиганд (ЕЬ), а к1 — константа скорости инактивации фермента. Считая, что скорость образования комплекса ЕЬ значительно выше скорости инактивации фермента, убыль немодифицированной формы фермента мож но описать следующим уравнением [c.364]

Для определения константы скорости инактивации Са—АТФазы НБД-хлоридом проводят модификацию 5Н-групп в той же среде, которая используется для определения кинетических характеристик 5Н-групп (с. 360). Реакцию начинают добавлением НБД-хлорида. По ходу реакции каждые 0,5—5 мин в зависимости от условий реакции отбирают аликвоты объемом 20—50 мкл и вносят их в 1 мл среды для определения активности Са—АТФазы (с. 359). Пробы инкубируют 1— [c.363]

При исследовании влияния различных веществ на скорость инактивации Са—АТФазы их вносят в среду для модификации 8Н-групп в нужных концентрациях (с. 360). [c.363]

Измерение констант скорости инактивации Са—АТФазы НБД-хло-ридом в присутствии разных концентраций лигандов (например, АТФ или АДФ) проводят, как описано выше. Расчет значений /С д возможен по схеме реакции инактивации, согласно которой с ингибитором может взаимодействовать фермент, свободный от лиганда (схема справедлива в случае Са—АТФазы и НБД-хлорида) [c.363]

Для получения графика температурной зависимости активности Са—АТФазы определяют линейность ферментативной реакции во вре- [c.364]

На примере миозиновой АТФазы рассматривается случай химической модификации с помощью некоторых сульфгидрильных реагентов, доказывается участие SH-rpynn в регуляции активности миозина (SH-группы непосредственно в активный центр этого фермента не входят), а также устанавливается важная роль гидрофобных взаимодействий в осуществлении регуляторного влияния на АТФазную активность миозина. Демонстрируется также стабилизирующее действие АТФ на структуру активного центра миозина. [c.398]

Поскольку препараты СР обладают не только Са-зависимой, но и Mg-зaви имoй АТФазной активностью, необходимо помимо общей АТФазной активности в соответствующие моменты времени определить Mg-зависимую АТФазную активность, которая измеряется в отсутствие добавки в среду инкубации СаСЬ. Активность Са-АТФазы рассчитывается как разность между общей и Mg-зaви имoй активностью. [c.363]

Активация миозиновой АТФазы может быть также достигнута путем внесения в среду инкубации неполярных или слабополярных органических растворителей, что свидетельствует о важной роли гидрофобных взаимодействий в осуществлении регуляции активности миозина. [c.398]

Исследование регуляторных свойств мембранных ферментов на примере Са—АТФазы саркоплазматического ретикулума. [c.503]

М) поступают ионы кальция, вызывающие различные биореакции, и в том числе сокращение гладких мыщц сосудов (рис. 7). Нормальный обратный отток отработавших ионов кальция против фадиента концентраций обеспечивается ферментом кальций-АТФазой (кальциевым насосом, использующим энергию АТФ, получаемую по реакции Enz +АТФ Enz-Ф + + АДФ + Е). При нарущениях их обратного транспорта из клетки или при слишком интенсивном их поступлении внутрь ее возникает гипертония, увеличивается нафузка на сердечную мышцу, что может привести к инфаркту миокарда. Дигидропи-ридины (ДГП) взаимодействуют со своими рецепторами (ДГП-рецепторы), которые, по-видимому, расположены в непосредственной близости к кальциевым каналам и блокируют последние. Это приводит к резкому уменьшению поступления ионов кальция в клетку и, таким образом, к расслаблению мышцы кровеносного сосуда, снижению давления и облегчению работы сердца при ишемической болезни и инфарктах. [c.127]

После получения меченных ФИТЦ препаратов СР определяют количество включенной метки. Для этого измеряют оптическую плотность образца, содержащего модифицированный белок, при 490 нм и рассчитывают концентрацию ФИТЦ, используя коэффициент молярной экстинкции метки, равный 64-10 М см . Для учета вклада светорассеивания в качестве контроля используют раствор везикул СР той же концентрации по белку, но не обработанных ФИТЦ. После этого рассчитывают включение метки в белок Са—АТФазы, зная, что молекулярный вес фермента равен 100 000, а содержание белка Са— АТФазы в препаратах легкой фракции СР составляет 807о- Для приведенных условий обработки включение метки составляет 1 моль/моль Са—АТФазы. [c.366]

Удобным объектом для изучения свойств мембранных ферментов является Са-АТФаза (КФ 3.6.1.38) СР скелетных мыщц кролика, поскольку содержание этого белка в легкой фракции мембран ретикулума достигает 80—90% выделяемые препараты СР стабильны при хранении и имеют постоянный белковый и фосфолипидный состав. Цель работы — знакомство с методическими подходами к изучению взаимодействия мембранных ферментов с субстратами и регуляторами, к анализу конформационной подвижности мембранных белков, а также характера и роли белок-липидных взаимодействий в биологических мембранах. [c.358]

Измерение АТФазной активности проводят в кювете объемом 5 мл при комнатной температуре в среде следующего состава — 0,1 М K I, 50 мкМ ЭДТА, 2 мМ Mg b, 5 мМ трис-НС1 (pH 8,0). В кювету перед измерением добавляют раствор Mg—АТФ до необходимой конечной концентрации. Линейность зависимости показания прибора от количества Н+-И0Н0В проверяют, добавляя в среду измерения небольшие порции раствора НС1 известной концентрации. Реакцию начинают добавлением СМЧ в количестве примерно 0,5 мг на пробу. При добавлении СМЧ измеряется АТФазная активность, а начальная скорость реакции не связана с неспецифическим ответом электрода на добавку. Чтобы проверить это, реакцию можно начать неактивным ферментом, например олигомицином — специфическим ингибитором АТФазы, действующим на Н+-канал необратимо. К порции СМФ добавляют олигомицин в стехнометрических количествах (из расчета 0,8 мкг олигомицина на [c.475]

Реакцию модификации 5Н-групп Са-АТФазы препаратов ретикулума НБД-хлоридом проводят в среде следующего состава 100 мМ КС1, 1 мМ ЭГТА, 30 мМ имидазол (pH 7,0), белок СР 0,2—0,3 мг/мл, [c.360]

Предлагаемая схема постановки эксперимента позволяет исследовать также влияние на конформационное состояние мембранного фермента Са—АТФазы различных мембранотропных соединений — локальных анестетиков, фармакологических агентов, органических растворителей и т. п. [c.362]

Бессонов В. А, Болдырев А. А., Ко Чже Чжун и др. Na, К-АТФаза температурная зависимость активности при гидролизе разных субстратов//Вестн. Моск. ун-та. Сер. биол. 1977. № 4. С. 17. [c.367]

Активность миозина в пробах рассчитывают в микромолях неорганического фосфата за 1 мин на 1 мг белка. Проводят сопоставление кривой титрования сульфгидрильных групп миозина ПХМБ и кривой изменения его активности при разной степени модификации. Отмечают полную потерю активности ферментом при 100%-ном блокировании SH-rpynn, а также 1,5—3-кратную активацию АТФазы при блокировании до 50% SH-rpynn. [c.399]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология