Полиакриламидные гели для аффинной хроматографии

Обычная анионообменная хроматография оказалась непригодной для очистки РНК, содержащих более 100—150 нуклеотидных остатков. Поэтому рибосомальные и матричные РНК обычно разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном или агарозном геле. К достоинствам этого метода относится высокая скорость процесса и высокая разрешающая способность по отношению к одноцепочечным молекулам, различающимся по своим размерам. Аффинная хроматография основана на том, что высокая степень специфичности может быть достигнута за счет гибридизации или химических взаимодействий между молекулами РНК, находящимися в растворе, и соответствующими соединениями, ковалентно связанными с твердым носителем. [c.176]

К матрице аффинного сорбента, помимо общих для всех хроматографических матриц требований (нерастворимость п гидрофильпость, жесткость, подходящая форма и размер гранул, химическая стабильность в условиях модификации и в самом хроматографическом процессе, отсутствие неспецифической адсорбцип ж др.), предъявляется требование наличия химических групп, позволяющих с помощью несложной химической реакции ковалеитио связывать с матрицей разнообразные биологические молекулы (лиганды и спейсе-ры). Наиболее удобными с этой точки зрения оказались гидроксильные группы полисахаридных матриц — агарозы и сефадексов, а также амидные группировки полиакриламидного геля. Если иметь в виду аффинную хроматографию белков или использование белко- [c.342]

Содержание спейсерных групп в обеих матрицах составляет 15 мкмоль на 1 мл влажного геля. Эта же фирма выпускает и два геля для аффинной хроматографии на чпсто полиакриламидной основе с одинаковыми короткими спейсерами следующего вида —СО—NH—(СН2)2—NHj. Их торговые названия — Aminoethyl Bio-Gel Р2 и Aminoethyl Bio-Gel Р150 . Очевидно, эти гели отличаются друг от друга по своей пористости. [c.359]

Аффинный электрофорез в полиакриламидном геле — это метод разделения, использующий преимущества и аффинной хроматографии, и электрофореза в иолиакриламидном геле [23, 24]. В микромасштабе он позволяет быстро анализировать смеси белков с избирательным разделением тех компонентов, которые обладают связывающими участками, комплементарными к иммобилизованным специфическим аффинным лигандам. Последние ковалентно связаны с частью матрицы полиакриламидного геля и образуют, таким образом, слой аффинного геля . Принцип этого метода хорошо иллюстрируется на типичном примере разделения активных белков аффинным электрофорезом, как показано на рис. 7.4. В стеклянных трубках равного диаметра готовят [c.166]

Подобно аффинной хроматографии, аффинный электрофорез в геле можно применять для определения констант диссоциации комплексов белок — лиганд. Принцип метода заключается в изучении зависимости подвижности данного белка от концентрации связанного лиганда в геле. Этот лиганд может быть либо ковалентно связан с гелем, либо только включен в гель (последнее обусловлено высокомолекулярными свойствами лиганда). Впервые такое использование электрофореза описано Такео и Накамурой [50], (хотя в этой работе еще не введен термин аффинный электрофорез ) константы диссоциации комплексов фосфорилаза— полисахарид определены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем различные концентрации ковалентно связанного полисахарида. Бег-Хансен [9] применил электрофорез на сефарозе с ковалентно связанным конканавалином А для определения констант диссоциации комплексов конканавалина А с сывороточными гликоиротеинами. [c.168]

Главный производитель полиакриламидных гелей — фирма Bio-Rad Labs.— выпускает их под названиями биогели Р получают эти гели сополимеризацией акриламида и N N-метиленбисакрил-амида. Биогели Р имеют различные размеры пор биогель Р-2— предел исключения молекулярной массы 1800, биогель Р-300— предел исключения 400 000. Все марки биогеля выпускаются с размерами гранул 50—100, 100—200, 200—400 и 400 мещ. Наряду с перечисленными фирма производит ионообменные производные этих гелей, например слабокислый катионообменник биогель СМ, а также промежуточные продукты для получения сор-6eHT0iB для аффинной хроматографии, такие, как аминоэтильное и гидразидное производные биогелей Р-2 и Р-60. [c.200]

В табл. 8.11 отсутствует сополимер этилена с малеиновым ангидридом, потому что из-за высокого содержания карбоксильных групп он постепенно все реже используется в аффинной хроматографии, а также для получения иммобилизованных ферментов, как это следует из табл. 11.1. Из табл. 11.1 также ясно видно, что столь же относительно редко используются полиакриламидные гели. Они действительно обладают рядом хороших свойств, но их устойчивость в щелочной среде плохая. При щелочном гидролизе и в сильно кислых средах образуются свободные карбоксильные группы. По-видимому, и.меются очень хорошие перспективы для применения оксиалкилметакрилатных гелей их производство все еще не развито в полной мере, однако с ними накоплен ценный опыт. Использование декстрановых гелей уменьшилось в связи с расширением применения гелей агарозы (за исключением некоторых специальных случаев) в настоящее время гели агарозы являются наиболее широко применяе мыми, как об этом можно судить по данным табл. 11.1. Поэтому в этой главе им уделено большое внимание. [c.228]

Полиакриламидные гели стабильны в диапазоне pH 1-г-Ю и при использовании обычных элюентов. Они не содержат заряженных групп, и поэтому ионообменные взаимодействия с хроматографируемыми веществами минимальны. Полиакриламидные гели биологически инертны и вследствие этого не подвержены микробной атаке. Поскольку частицы геля сильно прилипают к чистой стеклянной поверхности, в работе [22] рекомендуется использовать силиконизированную стеклянную или полиэтиленовую лабораторную посуду. Недостаточная механическая прочность полиакриламида ограничивает его применение в качестве матрицы для аффинной хроматографии. [c.23]

Один из основных производителей полиакриламидных гелей— Bio-Rad Laboratories — выпускает продукт под торговым названием биогель Р . Он получается сополимеризацией ак-риламида и Ы,Ы -метиленбисакриламида. Биогель Р производится с различным размером пор (от биогеля Р-2 с пределом исключения по молекулярной массе 1800 до биогеля Р-300 с пределом исключения по молекулярной массе 400 000), Все виды биогелей выпускаются с размерами частиц 50—100, 100— 200, 200—400 и 400 меш. Помимо этих продуктов фирма Bio- Rad Labs, выпускает гели-ионообменники, например слабый кислотный катионообменник биогель СМ, а также промежуточные продукты для аффинной хроматографии, такие, как аминоэтильные или гидразидные производные биогелей Р-2 и Р-60. [c.23]

По вполне понятным причинам при поиске аффинных сорбентов внимание в первую очередь было обращено на субстрат рестриктаз — ДНК- В ряде случаев для очистки этих ферментов была использована колонка с однонитевой ДНК-агарозой, приготовленной смешиванием расплавленной горячей агарозы с денатурированной дезоксирибонуклеиновой кислотой тимуса теленка по методу Шеллера с сотр. [236]. Предполагалось [217], что с сорбентом преимущественно будут связываться неспецифические нуклеазы, а рестриктазы, субстратом которых является нативная ДНК, окажутся во фракции несорбировавшихся белков. Для некоторых рестриктаз это предположение, согласно утверждению Робертса [217], оправдалось и была получена хорошая их очистка. Наряду с этим было обнаружено, что некоторая часть исследованных специфических эндонуклеаз достаточно прочно связывалась с однонитевой иммобилизованной ДНК и элюировалась градиентом соли острыми пиками. В этом случае тоже наблюдалась значительная очистка этих ферментов от неспецифических нуклеаз. Хроматография на однонитевой ДНК, иммобилизованной на агарозе или целлюлозе, была применена на последней стадии очистки рестриктаз Hha I [174], Bsp I [152] и E oR I [184]. В качестве сорбента для очистки специфических эндонуклеаз нашла применение и нативная ДНК, иммобилизованная на полиакриламидном геле или целлюлозе, которые были использованы в случае Bsu I [58] и ВЬе I [c.155]