Аффинные лиганды матрицей

Хотя синтез аффинного сорбента с индивидуальной специфичностью при наличии одной из продажных активированных матриц и не представляет особого труда, он все же требует наличия достаточного количества очищенного аффинного лиганда, не инактивирующегося в условиях его посадки на матрицу. Заметим, что после посадки лиганда на матрицу прочность связывания с ним биоспецифического партнера может сильно уменьшиться по сравнению с тем уровнем, который наблюдался при образовании их свободного комплекса в растворе (иной раз константа диссоциации комплекса на сорбенте может оказаться на три порядка выше, чем в растворе). Это обстоятельство играет важную роль при осуществлении конкурентной аффинной элюции вещества с сорбента с использованием свободного лиганда (см. ниже). Тем не менее прочность аффинного связывания в большинстве случаев оказывается достаточной для удержания нужного вещества на матрице в условиях отмывки с нее всех сопутствующих ему примесей. Нередко прочность комплекса вещества с аффинным лигандом увеличивается, если последний имеет некоторую свободу ориентирования в пространстве, т. е. закреплен на матрице с помощью спейсера. [c.362]

Этот кофермент участвует во множестве ферментативных реа к ций и имеет широкое поле применения в качестве аффинного лиганда с групповой специфичностью. Его закрепляют на матрице через [c.364]

Однако кажущаяся простота метода и отсутствие у новичка представления о возможных трудностях, сопровождающих его применение на практике, могут привести к обескураживающим неудачам. Действительно, трудно заранее предугадать, какой аффинный лиганд полезнее выбрать — с высоким или низким сродством, какова наиболее благоприятная концентрация этого лиганда в сорбенте, какую роль должна играть матрица, какие носители подходят и какие не подходят для иммобилизации аффинного лиганда. Например, отлично зарекомендовавшие себя с точки зрения иммобилизации ферментов носители на основе кремнезема оказываются в ряде случаев совершенно непригодными для использования в аффинной хроматографии из-за высокой неспецифической сорбции. [c.5]

Различия между Л01 и ДОь обусловлены изменением стерической доступности аффинного лиганда после его иммобилизации, его модификацией при связывании с носителем, природой нерастворимой матрицы и т. п. [c.64]

Влияние пористости геля на доступность иммобилизованного аффинного лиганда, необходимую для комплексообразования с комплементарной макромолекулой, показано на рис. 5.2. Лоу и Дин [18] изучили влияние степени пористости матрицы сефадекса [c.64]

L — ковалентно привязанный к матрице аффинный лиганд, / — нефиксированный ингибитор, Е фермент [c.92]

До последнего времени основной причиной неспецифической сорбции считался ионный обмен. Как правило, полагали, что при исключении ионных групп из материала матрицы и введении пространственных групп мешающие Э( )фекты могут быть преодолены. Конечно, во многих случаях аффинные лиганды сами имеют ионогенные свойства и могут связывать, осуществляя ионный обмен. [c.94]

Когда аффинный лиганд привязан к матрице (например, в 0,2 М К-фосфатном буфере, pH 7,5), карбоксильные группы освобождаются (либо в результате связывания с белком, либо из-за гидролиза в водной среде), и они придают сорбенту полианионные свойства. [c.200]

При синтезе аффинного геля возможны два подхода. Согласно первому, лиганд (в состав которого входит пространственная группа) синтезируется в свободном виде в растворе классическими методами органической химии, очищается и присоединяется к матрице геля на последней стадии. Некоторые исследователи предпочитают именно этот подход, поскольку в гель не вводятся незащищенные пространственные группы, которые содержат ионные группировки, обусловливающие неспецифическую сорбцию этот вопрос подробно рассматривается в разд. 10,3. Второй подход состоит во встраивании пространственной группы в гель на первой стадии с последующим связыванием аффинного лиганда на второй стадии. Берри и сотр. [3] сравнили две методики и показали преимущества последней. Привязка пространственной группы к гелю с последующим прикреплением аффинного лиганда обычно технически менее сложна, особенно для неспециалистов в органической химии. [c.210]

Высокая проницаемость нерастворимых носителей, которая является предпосылкой легкости образования специфических комплексов высокомолекулярных соединений, не является достаточным условием для пространственной доступности участков связывания. Для низкомолекулярных аффинных лигандов в особенности необходимо ввести пространственные группы между этими лигандами и поверхностью матрицы. Природе этих пространственных групп уже уделено много внимания. [c.228]

Г руппа на аффинном лиганде pH реакции связывания Группа на нерастворимой матрице Активирующий реагент Раздел, где упоминается метод [c.230]

Эффективная активность лиганда под влиянием иммобилизации может меняться самым различным образом. На взаимодействие иммобилизованного лиганда с выделяемыми молекулами может оказывать значительное очень разнообразное влияние микроокружение, образуемое матрицей (плотность заряда, стерические препятствия и т. д.) оно же может также влиять и на структуру аффинного лиганда. Иммобилизация приводит также к изменениям в химической структуре, которые различным образом изменяют его молекулярные свойства. Так, например, существенную роль играет число связей между аффинным лигандом и нерастворимым носителем. Из сопоставления результатов, представленных на рис. 10,10,6 и в, следует, что неблагоприятное влияние возрастающего числа связей между молекулами соевого ингибитора трипсина и сефарозой 4В вызвано увеличением pH с 7,2 до 8,5 во время связывания белка после активации бромцианом. [c.274]

Методы, основанные на применении иммобилизованных биологических молекул, оказались полезными во многих областях [38]. Многочисленные примеры демонстрируют, каким образом биологически активные вещества, связанные с нерастворимыми матрицами, используются в аффинной хроматографии. Исследование ферментов, связанных с нерастворимыми матрицами, так же как и их применение, тесно связано с аффинной хроматографией. Развитие технологии иммобилизации ферментов происходило одновременно с работами в области аффинной хроматографии. Изучение иммобилизованных ферментов — один из наиболее развивающихся разделов современной энзимологии. Кроме того, иммобилизованные ферменты являются также наиболее изученными аффинными лигандами, и поэтому им посвящена отдельная глава. [c.420]

Как уже указывалось, присоединение аффинного лиганда к матрице триазиновым методом первоначально было разработано для целлюлозных носителей [49]. Присоединение лиганда к носителю с помощью диазониевых групп в 1951 г. Кемпбелл [7] впервые использовал для связывания биологически активного соединения с целлюлозой. Метод присоединения веществ со свободной аминогруппой к карбоксильной группе с помощью водорастворимого карбодиимида был первоначально разработан для связывания аффинных лигандов опять-таки с целлюлозой [100] [c.28]

Колонка для аффинной хроматографии заполняется связанной с лигандом матрицей и уравновешивается тем же буферным раствором, который используется для растворения исследуемого соединения. Буферный раствор должен иметь такие pH и ионную силу, чтобы обеспечивать оптимальные условия для сшивания лиганда с [c.103]

Поэтому мы начнем изложение с краткой характеристикп используемых в настоящее время компонентов аффинных сорбентов матриц, лигандов и спейсеров. Одновременно рассмотрим способы соединения их между собой, ограничившись только теми немногими пз большого числа вариантов, испробованных и описанных в прошлом десятилетии, которые выдержали проверку временем. Впрочем, к ним имеет смысл добавить два-три только что предложенных способа, обещающих какие-то новые преимущества. Затем можно будет проанализировать более подробно параметры и характерные особенности процесса аффинной хроматографии и на основании этого анализа сформулировать некоторые рекомендации по практической постановке эксперимента. [c.342]

Однако для достижения хорошей доступности иммобилизованных аффинных лигандов и связываюшнх центров биологических макромолекул даже высокая пористость нерастворимого носителя не достаточна. Химические группы аффинанта, принимающие участие во взаимодействии с макромолекулярным веществом, также должны быть достаточно удалены от поверхности нерастворимой матрицы, чтобы не возникало стерических затруднений. [c.68]

Ограниченная диффузия возникает, если молекулярная диффузия в порах матрицы затруднена из-за экранирования подхода макромолекул к прикрепленному аффинному лиганду. Экспериментально вклад этой диффузии можно определить с большим трудом, но для аффинной хроматографии на очень пористых носителях эти трудности становятся минимальными. На практике для достижения равновесных условий желательно, чтобы скорость потока была по возможности низкой. Например, при скорости потока 400 мл/ч для выделения стафилококковой нуклеазы на колонке объемом 20 мл небольшие количества нуклеазы появлялись в первом пике вместе с белковыми примесями, особенно если общая концентрация белков в образце была высока (20—30 мг/мл) [5]. Однако даже при такой высокой скорости потока нуклеаза полностью сорбировалась, если наносился менее концентрированный образец. Зависимость связывания лактатдегидрогеназы на №-(6-аминогексил)-5 -АМР — сефарозе от скорости потока пссле-дована Лоу и др. [21]. Было найдено, что увеличение скорости потока относительно мало влияет на сорбцию. При высоких скоростях потока эффективность колонки (ВЭТТ), а также связываемость р уменьшаются. Влияние скорости потока более заметно в небольших колонках, с которых часть белка с ферментативной активностью элюируется со свободным объемом. Влияния концентрации инертного белка (бычьего сывороточного альбумина) при высоких скоростях потока (67 мл/ч) также не обнаружено. [c.84]

В этот обзор включены также аффинные лиганды с очень узкой специфичностью. Например, если к носителю прикрепить ингибитор, специфичный для единственного фермента, образующийся сорбент также будет специфичен только для данного фермента. Однако для использования специфических лигандов необходимо проводить различные и часто очень трудоемкие синтезы сорбента для каждого разделения. Не все аффинанты, которые подходят для комплементарного связывания макромолекул, имеют также подходящие функциональные группы для их прикрепления к нерастворимому носителю. Эти группы долл ны быть предварительно введены в аффинный лиганд, так же как и подходящей длины пространственная ножка , необходихмая главным образом для низкомолекулярных аффинных лигандов (она позволяет осуществлять их специфические взаимодействия с сорбируемым веществом). Практическая полезность специфических сорбентов возрастает, если для их приготовления вместо узко специфических лигандов использо-вать так называемый общий лиганд [37]. Очевидно, что матрица с групповой специфичностью, содержащая общий лиганд, проявляет аффинность к большой группе биологических макромолекул. Например, ферменты метаболизма аспарагиновой кислоты обнаруживают групповую специфическую [c.104]

И декстрин. Через 1 год хранения л иофильно сухого порошка при те.мпературах <8°С теряется 2% нуклеотидного материала. Однако это происходит в результате отщепления моно-мера от полимера, а не отщепления аффинного лиганда от матрицы. [c.142]

Большие количества иммобилизованных аффинных лигандов производятся также фирмой РЬ Bio hemi als (табл. 6.5). Часто аффинный лиганд можно связать с матрицей несколькими способами в табл. 6.5 приведены типы связывания, указывающие метод присоединения. [c.142]

Аффинный электрофорез в полиакриламидном геле — это метод разделения, использующий преимущества и аффинной хроматографии, и электрофореза в иолиакриламидном геле [23, 24]. В микромасштабе он позволяет быстро анализировать смеси белков с избирательным разделением тех компонентов, которые обладают связывающими участками, комплементарными к иммобилизованным специфическим аффинным лигандам. Последние ковалентно связаны с частью матрицы полиакриламидного геля и образуют, таким образом, слой аффинного геля . Принцип этого метода хорошо иллюстрируется на типичном примере разделения активных белков аффинным электрофорезом, как показано на рис. 7.4. В стеклянных трубках равного диаметра готовят [c.166]

В разд. 5.1 обсуждались гидрофобные и гидрофильные свойства пространственной группы. О Карра и др. [51] упоминают три типа аффинных лигандов, иммобилизованных через гидрофобные (А, Г и Ж) и гидрофильные (Б, В, Д, Е и 3) пространственные группы А — В — иммобилизованный оксамат Г — Е — азо-МАВ+-связанный в 8-положение Ж и 3 — 6-меркаптопуриновый аналог ЫАО+, связанный в 6-положение (заштрихованные части слева представляют матрицу сефарозы 4В). [c.213]

Из вышеизложенного следует, что кроме природы нерастворимого носителя существенную роль играет также метод связывания. В табл. 8.12 дан обзор методов связывания, рассмотренных в разд. 8.2 и 8.3. При выборе методов связывания главное внимание уделяется тому, какие группы аффинного лиганда можно использовать для присоединения к нерастворимой матрице без затрагивания связывающих участков аффинных лигандов. Если доступно несколько групп, рекомендуется выбрать наиболее избирательный метод, потому что желательна специфическая связь через одну определенную функциональную группу. Присоединение не должно приводить к появлению в специфическом сорбенте неспецифически сорбирующих групп. Поэтому лучше привязывать к аффинному лиганду пространственную группу и только модифицированный таким образом лиганд присоединять к нераствори-мовду носителю. В результате образования связи между поверхностью нерастворимого носителя и аффинным лигандом не должно возникать ни в носителе, ни в аффинном лиганде неспецифически сорбирующих групп эта связь должна быть устойчивой в ходе сорбции, десорбции и регенерации (см. разд. 8.5). При выборе метода необходимо принимать во внимание также зависимость устойчивости аффинного лиганда от pH. Кислые протеина-зы, например, нельзя связывать в щелочных средах, поскольку они будут при этом инактивироваться. Поэтому в табл. 8.12 приводится также значение pH, при котором проводится связывание. Однако во многих методах могут быть получены хорошие результаты даже при низких pH (связывание в нейтральной среде на [c.229]

В разд. 5.3 детально обсуждалось влияние концентрации иммобилизованных аффинных лигандов. Очевидно, что после присоединения аффинного лиганда к инертному носител10 перед сорбцией очень полезно определить долю молекул, ковалентно присоединившихся к матрице. Подготовленный аффинный гель не должен содержать реакционноспособных групп (о блокировании остаю- [c.243]

Изучение оптимальных условий сорбции предполагает, что аффинный лиганд присоединен к нерастворимому носителю с достаточно высокой пористостью и на достаточном расстоянии от его поверхности (разд. 5.1), чтобы сохранить даже после присоединения высокое сродство к выделяемому веществу (разд. 5.2). Емкость специфического сорбента определяется концентрацией доступных аффинных лигандов и их константами диссоциации пз комплекса с выделяемым веществом (рис. 3.3). В разд. 5.3 ул<е обсуждалась оптимальная концентрация им.мобнлизованного аффинного лиганда, которая должна была бы обеспечить достаточную емкость и одновременно позволить освобождаться выделяемому веществу из специфического комплекса с иммобилизованным аффинантом в достаточно мягких условиях, не приводя, однако, к неспецифической сорбции. Свойства пространственной группы, вводимой между аффинным лигандом и поверхностью нераство-рихмой матрицы [6], могут оказывать влияние на свойства сорбента, как и концентрация аффинного лиганда. Специфический сорбент должен быть приготовлен таким способом, чтобы все группы, способные к присоединению, были блокированы (разд. 8.4) и чтобы число групп, способных принимать участие в неспецифической сорбции, было минимальным (разд. 10.3). Однако особенно важно, чтобы все молекулы аффинного лиганда, которые не присоединились к носителю ковалентной связью, были тщательно отмыты (разд. 8.6). [c.258]

Если аффинный лиганд присоедипен к матрице с помощью азосвязи или сложноэфирными связями тиолов или спиртов, с нерастворимой матрицы можно снять комплекс аффинного лиганда с выделяемым веществом, а затем аффинный лиганд отделить диализом или гель-фильтрацией. Этот способ, однако, не позволяет повторно использовать аффинную матрицу. Носители такого типа детально обсуждены в разделе о ковалентной хроматографии (разд. 7.2). [c.272]

Специфические сорбенты, использующие исключительные свойства биологически активных веществ образовывать специфические и обратимые комплексы, в огромной степени облегчают выделение ряда ферментов, их ингибиторов и кофакторов, антител и антигенов, лектинов, гликопротеинов, гликополисахаридов, нуклеиновых кислот, нуклеотидов, жиров, транспортных и рецепторных белков, гормонов и их рецепторов, клеток и многих других соединений, как это представлено в обзорной табл. 11.1. Наряду с названием выделяемого вещества в таблице приведены также используемые аффинные лиганды, нерастворимые носители и пространственные группы, причем указано, аффинный лиганд или нерастворимая матрица модифицированы данной пространственной группой. Обзорная таблица включает выделения веществ как с помощью типичной биоаффинной хроматографии, так и с помощью гидрофобной или ковалентной хроматографии. [c.367]

В качестве аффинных лигандов можно использовать любые соединения, прочно, специфично и обратимо связывающиеся с выделяемым веществом. Химическое строение аффинных лигандов может быть самым различным. Поскольку в настоящее время метод аффинной хроматографии применяется главным образом для выделения ферментов и их ингибиторов [89J, мы рассмотрим примеры, взятые из этой области. Как уже упоминалось, при выделении фермента аффинными лигандам1И могут служить его ингибитор, аналогичный субстрату, а также эффектор, кофактор и в отдельных случаях даже субстрат. Это справедливо и для фермента, требующего длл реакции два субстрата, но способного достаточно сильно связываться только с одним из них. Субстрат также можно использовать для адсорбции фермента в таких условиях, когда фермент связывается, но сам не способен катализировать реакцию (например, в отсутствие ионов металлов, необходимых для реакции), а также когда константа Михаэлиса зависит от pH или температуры. Аффинный адсорбент для выделения белков обычно трудно получить из аффинного лиганда, если константа диссоциации его комплекса с белком превышает (0,5—1,0)-Ю [16]. Однако Стире и сотр. [84] показали, что очень эффективный адсорбент для р-галактозидазы можно получить даже из такого относительно слабого ингибитора, как н-аминофенил-р-о-тиогалактопирано-зид (/i , 5-10 ). Этого удается достигнуть, повышая концентрацию нерастворимого аффинного лиганда и увеличивая расстояние между аффинным лигандом и матрицей носителя, что приводит к максимальной доступности аффинного лиганда, для белка в растворе. [c.9]

К типичным гидрофобным адсорбентам, имеющимся в продаже, относятся адсорбенты, в состав которых входят линейные алифатические цепи, содержащие 4, 6, 8 и 10 атомов углерода (Р. Ь. В1осНеш1са18), а также адсорбенты с такими же цепями, но имеющими концевую аминогруппу (рис. 4.51,Л). Адсорбенты последнего типа предназначены преимущественно для присоединения аффинных лигандов, однако они сами по себе представляют интересные гидрофобные адсорбенты, в которых имеется группа, потенциально способная к образованию водородных связей и электростатическим взаимодействиям. Важно также отметить, что эти адсорбенты делаются на основе агарозы, активированной бромцианом, и поэтому содержат положительно заряженную группу на другом конце алифатической цепи (см, рис. 4.35). Доступны также фенилагарозы, в которых бензольное кольцо связано с матрицей через простые эфирные связи с глицерином (например, фенилсефароза рис. 4.51, ). [c.183]

Любой из компонентов названных и им подобных биоспецифиче-ских пар можно надежно закрепить на матрице в качестве так называемого лиганда . С его помощью второй партнер пары может быть извлечен из смеси с другими, не комплементарными лиганду веществами и временно задержан на матрице в составе биоспецифического (аффинного) комплекса. Иногда это может быть не одно, а несколько родственных или схожих по своей структуре веществ, узнающих один и тот же лиганд, например изоферменты пли ряд ферментов, использующих один и тот же кофермент, различные виды антител к одному и тому же антигену и т. д. [c.339]

Есть еще одна особенность аффинной хроматографии, которую следует отметить с самого начала. Способ связывания биологически активного лиганда с матрицей обязан не только обеспечивать сохранение его активности, по п не создавать стерических препятствий для взаимодействия сорбируемого вещества с лигандом. Когда в качестве лиганда выступает биополимер (белковый антиген или субстрат, нуклеиновая кислота) и его участок биоспецифического взаимодействия оказывается достаточно удаленным от точки закреплетшя па матрице, то эта проблема не возникает. [c.341]

К матрице аффинного сорбента, помимо общих для всех хроматографических матриц требований (нерастворимость п гидрофильпость, жесткость, подходящая форма и размер гранул, химическая стабильность в условиях модификации и в самом хроматографическом процессе, отсутствие неспецифической адсорбцип ж др.), предъявляется требование наличия химических групп, позволяющих с помощью несложной химической реакции ковалеитио связывать с матрицей разнообразные биологические молекулы (лиганды и спейсе-ры). Наиболее удобными с этой точки зрения оказались гидроксильные группы полисахаридных матриц — агарозы и сефадексов, а также амидные группировки полиакриламидного геля. Если иметь в виду аффинную хроматографию белков или использование белко- [c.342]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология