Гели, используемые в методе ГПХ полиакриламидные

Электрофорез, процесс разделения молекул, основанный на разной скорости перемещения их в электрическом поле, проводят самыми разными способами. Очень небольшое количество раствора, содержащего смесь белков (например, белков сыворотки крови), наносят в виде тонкой полоски на лист фильтровальной бумаги или ацетата целлюлозы. Лист насыщают буфером и пропускают через него электрический ток. Напряжения в несколько сот вольт достаточно для разделения белков сыворотки в течение 1 ч. Для ускорения процесса и снижения диффузии низкомолекулярных веществ широко используют высоковольтный электрофорез. Прикладываемое напряжение составляет в этом случае 2—3 тыс. вольт. Образец постоянно охлаждают с помощью термостатируемых пластин иногда для той же цели всю систему погружают в сосуд с керосином. Электрофоретическое разделение больших количеств материала проводится в плоских лотках, заполненных крахмальным или каким-либо другим гелем. Одним из наиболее распространенных и чувствительных методов разделения белков является электрофорез в колонке, заполненной полиакриламидным гелем. Этот метод, в настоящее время сильно усовершенствованный, позволяет проводить разделение молекул одновременно и по размеру, и по электрическому заряду его называют методом электрофоретического молекулярного сита 127, 128]. [c.164]

При разделении нуклеиновых кислот используют те же методы, что и при фракционировании белков, однако имеются ограничения, обусловленные большим диапазоном величин молекулярной массы (2-10 —Ы0 ° Да), отклонениями от глобулярной формы, различиями в четвертичной структуре (двухнитевые, однонитевые, кольцевые), значительным отрицательным зарядом в нейтральной области pH. Поэтому методы гель-фильтрации и ионообменной хроматографии не получили широкого распространения при фракционировании нуклеиновых кислот и значительно уступают ультрацентрифугированию и электрофоретическому разделению в геле агарозы, полиакриламидном геле или их смеси. Поскольку величина отрицательного заряда нуклеиновых кислот и продуктов их расщепления мало зависит от pH, а отношение заряда к молекулярной массе сохраняется практически неизменным, разделение нуклеиновых кислот при электрофорезе определяется не их зарядом, а размером молекул. При наличии маркеров с известной молекулярной массой возможно определение молекулярной массы препаратов нуклеиновых кислот и их фрагментов. [c.171]

Метод окрашивания полисахаридов перед электрофорезом [478] использовали Павленко и Оводов [479] для анализа ряда нейтральных и кислых полисахаридов с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Для разделения различных компонентов полидисперсных декстранов и амилопектинов с помощью диск-электрофореза ими использованы буферы, содержащие тетраборат натрия (или борную кислоту), трис(гидроксиметил)-аминометан и натриевую соль ЕВТА при pH 9,2—9,3. Электрофорез в полиакриламидном геле используют также для анализа пектиновых веществ [480] и сульфатированных полисахаридов из морских водорослей [481], однако основной областью применения данного метода в химии углеводов является исследование гликопротеинов [482] и гликозаминогликанов (483, 484]. В по- [c.75]

Молекулярный вес продуктов диссоциации определяют как химическими (ср. разд. 10.2.3 и 10.2.4), так и физическими методами. Для установления молекулярного веса обычно используют методы ультрацентрифугирования (седиментация, диффузия, седиментационное равновесие [104, 105, ПО—115]), измерения светорассеяния [116—118] и осмотического давления [136. Характеристическая вязкость полимерных цепей в конформации статистического клубка связана простым соотношением с молекулярным весом. Следовательно, он может быть найден по измерению вязкости [137] (ср. разд. 10.2.7.5). Плотности и вязкости различных водных растворов представлены в табл. 2. Размер полипептидных цепей при денатурации можно оценить пО полипептидам-маркерам с известными молекулярными весами при электрофорезе в полиакриламидном геле (ср. разд. 10.2.7.4) и гель-фильтрации (ср. разд. 10.2.7.5). [c.414]

Нуклеиновые кислоты характеризуются отчетливым отрицательным зарядом и очень высокой молекулярной массой. Поэтому нейтральные гомогенные гели с достаточно большими порами обеспечивают хорошее разделение этих соединений. Размер пор, требуемый для исследования нуклеиновых кислот и их субъединиц, можно определить методом гель-электрофореза при градиенте концентрации, как для белков (см. табл. 12.6). Если механические свойства неплотного полиакриламидного геля непригодны, можно использовать смешанный гель, содержащий 2,5% полиакриламида и 0,5% агарозы. При анализе субъединиц более низкой молекулярной массы концентрацию полиакриламида увеличивают до 3% при 0,5%-ной концентрации агарозы в [c.350]

Обзор текущей литературы по биохимии показывает, что в настоящее время методы электрофореза в полиакриламидном геле используются очень широко. Главной областью их применения является разделение смесей белков [54—59] и компонентов РНК [60—63]. Этот метод можно использовать и при изучении особенностей реакций нуклеиновых кислот или полипептидов [64]. [c.153]

Для анализа антигенов, разделенных с помощью электрофореза или электрофокусирования в полиакриламидном геле, разработаны многочисленные методы иммунодиффузии. Так, для этой цели можно использовать различные варианты двойной иммунодиффузии. Цилиндрические столбики геля разрезают продольно на две половинки (см. разд. 1.15.6), а из пластин нарезают полоски, содержащие разделенные антигены. Разрезанный гель помещают на стеклянные пластинки, заливают их теплым раствором агара и дают ему застыть. Канавки для антител располагают на соответствующем расстоянии от полиакриламидного геля. Как только полиакриламидный гель покроется слоем агара толщиной 1 мм, в непосредственной близости от него сразу же вырезают канавку для антисыворотки. Если для анализа используют разрезанные вдоль столбики полиакриламидного геля, то их кладут на слой агарового геля и в нем рядом с полоской геля по обеим ее сторонам быстро вырезают канавки для антител. Преципитаты образуются под полоской полиакриламидного геля. Столбик полиакриламидного геля можно также разрезать в поперечном направлении на диски и проанализировать присутствующие в них антигены методом двойной радиальной диффузии 203, 394]. [c.244]

При формировании геля в растворе, содержащем фермент, последний захватывается в образующийся гелевый носитель. Контролируя степень сшивки геля, этот метод можно использовать для любого фермента, поскольку в геле белковые молекулы удерживаются трехмерной решеткой.уНа рис. 6.3 показана структура полиакриламидного геля, применявшегося в ранних разработках ферментного электрода. Кроме [c.84]

Гели. Агаровые, крахмальные, полиакриламидные и другие гели следует готовить непосредственно перед использованием, а это зачастую процесс, требующий времени. Свойства гелей таковы, что и адсорбция, и электроосмос, и расширение зон в результате диффузии очень незначительны. Гель-электрофорез применяется и для препаративных целей, но гораздо более широко используется как аналитический метод и особенно ценен для разделения смесей веществ, имеющих одинаковые заряды, но слегка различающиеся массы. [c.122]

Несмотря на свою короткую историю, электрофорез в полиакриламидном геле уже очень широко используется в самых различных областях биохимии [2, 9]. Поддерживающей средой в этом методе электрофореза служит сополимер акриламидных и метиленбис- [c.14]

Основу руководства составили работы, которые на протяжении ряда лет используются в учебном процессе на кафедре биохимии 1 ММИ им. И. М. Сеченова. В практикум включены работы, знакомящие студентов с современными методами исследования и проблемами биохимии, такими, как электрофорез белков в полиакриламидном геле, ионообменная хроматография белков, гель-фильтрация, изучение четвертичной структуры белков и др. Подобраны и приспособлены к условиям работы в студенческой лаборатории современные методы выделения и изучения ферментов, их количественного определения в биологических жидкостях и тканях. Авторы стремились по возможности использовать в качестве объектов изучения биологические материалы, с которыми обычно имеет дело клиническая биохимия. [c.3]

Для контроля за степенью очистки белков чаще применяют метод электрофореза. Большинство авторов в качестве носителя используют гомогенные гели или градиент концентрации акриламида. Основной способ при этом — электрофорез в диссоциирующей среде ДДС-Na соответственно процедуре, которую описал Лэммли [68]. В определенных случаях завершающим приемом при этом являются иммунодиффузия [29, 114] либо иммуноэлектрофорез [17, 80, 118]. При исследовании структуры некоторые авторы прибегают к двумерному электрофорезу. Тогда первая миграция молекул может происходить в гомогенном геле полиакриламида с ДДС-Na или без него во втором направлении молекулы мигрируют в полиакриламидном геле с ДДС-Na в присутствии восстановителей дисульфидных связей (р-меркапто-этанол) [10, 40, 61, 78]. Чтобы охарактеризовать субъединицы легуминов гороха и конских бобов, Матта и др. [77, 78] применяют сочетание ДДС-Na с р-меркаптоэнталом и электрофокусированием. Рестани и др. [92 пользуются этим же способом применительно к глобулинам люпина, а Ху и Еэзен [53] демонстрировали гетерогенность белков сои. Указанные методы с [c.155]

Наряду с сефадексом для гельфильтрации успешно применяются другие материалы, такие как агар и синтетические гидрофильные полимеры, например, полиакриламидные гели — биогели, а также гидрофобные полимеры, набухающие в органических растворителях и используемые для фракционирования гидрофобных полимеров. Весьма удачным для белковой физико-химии оказалось использование агара. Пористость агарового геля зависит от концентрации агара. С уменьшением его концентрации в геле доступность внутренних частей зерен для макромолекул увеличивается. На низкоконцентрированных гелях (2,5—5%) имеется возможность разделять белки с молекулярным весом вплоть до миллионов [25]. Так, гемоцианины, тироглобулин, у-глобу-лин человека, сывороточный альбумин, а- и р-лактоглобулин обладают существенно различными скоростями перемещения на колонке из агара. Стандартизация метода гельфильтрации позволяет его использовать не только для фракционирования белков, но и для определения молекулярного веса в весьма простом хроматографическом эксперименте. Интересной областью приложения гельфильтрации на сефадексе явилось определение молекулярного веса мономерных форм белков, способных к ассоциации. Как известно, полная диссоциация подобных комплексов наблюдается при столь низких концентрациях растворов, когда использование [c.204]

Зоны можно также сфокусировать в результате наложения молекулярно-ситового эффекта, например, если электрофорез ведется в полиакриламидном геле, то в результате влияния градиента плотности. При проведении электрофореза биополимеров все чаще используются принципы аффинности и иммунной преципитации. Контролировать ход электромиграционного разделения с высоким разрешением удобно с помощью метода двумерного электрофореза и иммунной преципитации. [c.283]

Методы электрофоретического разделения в полиакриламидном и агарозополиакриламидном гелях широко используются в настоящее время для фракционирования нуклеиновых кислот. Преимуществом этих методов является их простота и возможность контролировать ве-нДичину пор геля. При наличии маркёров с известной молекулярной массой или коэффициентом седиментации очи могут быть использованы для характеристики относительной молекулярной массы выделенных препаратов нуклеиновых кислот. [c.173]

Обычная авторадиография является одним из наиболее подходящих методов определения радиоактивности на полиакриламидных гелях при работе с соединениями, меченными одним изотопом (но не тритием). Этот метод удобен и для сравнения нескольких гелей, когда с образцов делают продольные срезы, накладывают их на бумажную подложку, высущивают и скрепляют с одним листом рентгеновской пленки для получения авторадиограммы. Для регистрации соединений, меченных тритием, по-видимому, чаще всего используют флюорографические методы Боннера и Лески [48], а также Лески и Миллза [50]. Однако при работе с соединениями, меченными двумя изотопами, метод авторадиографии становится довольно трудоемким. [c.152]

Аффинный электрофорез в полиакриламидном геле — это метод разделения, использующий преимущества и аффинной хроматографии, и электрофореза в иолиакриламидном геле [23, 24]. В микромасштабе он позволяет быстро анализировать смеси белков с избирательным разделением тех компонентов, которые обладают связывающими участками, комплементарными к иммобилизованным специфическим аффинным лигандам. Последние ковалентно связаны с частью матрицы полиакриламидного геля и образуют, таким образом, слой аффинного геля . Принцип этого метода хорошо иллюстрируется на типичном примере разделения активных белков аффинным электрофорезом, как показано на рис. 7.4. В стеклянных трубках равного диаметра готовят [c.166]

Для разделения канамицинов были использованы методы бумажной хроматографии [39, 52—55], ТСХ [39, 54], электрофореза [56], ГЖХ [57] и ВЭЖХ [58]. Производные канамицина и его биосинтетические продукты были разделены с помощью бумажной хроматографии [59, 60] и ТСХ [60—63]. Для разделения компонентов неомицина и его N-ацетилпроизводных были применены разнообразные системы бумажной хроматографии. [39, 60, 64—75]. Для этой же цели пригодны тонкослойные пластинки с силикагелем [75—79], углем [80], оксидом алюминия [81, 82], целлюлозой MN-300 [76, 83] и с кизельгуром [76]. Электрофоретическое разделение неомицинов осуществлено на ацетате целлюлозы [84, 85], на бумаге ватяан № 3 ММ [46] и в полиакриламидном геле [86]. Описан также газохроматографический анализ неомицинов [87, 88]. [c.147]

Пастевка и др. [974] определяли подвижность компонентов трех основных типов гаптоглобина с помощью дпск-электрофо-реза в полиакриламидном геле, используя в качестве стандарта трансферрин С. Эти авторы пытались идентифицировать фенотип Нр в анализируемых сыворотках по характеру расположения белковых зон на электрофореграмме после их окрашивания амидовым черным. Феррис и др, [378] анализировали комплексы гаптоглобин — гемоглобин методом вертикального электрофореза в пластине 7%-ного полиакриламидного геля с буферной системой трис-борат-ЭДТА (pH 8,3—8,4). Шеридан и др. [1178] для разделения комплексов гемоглобин — гаптоглобин применяли электрофорез в непрерывном вогнутом градиенте концентрации геля. Такая методика лучше, чем другие, обеспечивает разделение полимерных форм, особенно в зоне высокополимерных комплексов. [c.342]

Антигены, Антигены, используемые для иммунизации, должны быть очень хорошо очищены, для чего можно использовать метод иммуноаффинной хроматографии или классические методы . Чистая GGT из почек быка может быть выделена солюбилизацией фермента в присутствии дезоксихолата натрия с последующей обработкой -бутанолом, фракционированием сульфатом аммония и хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе [27]. Полученный после разделения на сефарозе 6В препарат GGT подвергается протеолитическому гидролизу бромелаином, и полученная GGT (легкая форма) очищается электрофорезом в полиакриламидном геле [28]. Чистая GGT из почек крысы (фермент П1) может быть получена [29] подобным методом. [c.153]

Диск-электрофорез кислой а-глюкозидазы проводят в 7,5% полиакриламидном геле при pH 4,3 с р-аланин-ацетатным электродным буфером (Маурер, 1971) время электрофореза 90 мин при силе тока 4 мА на трубку. После окончания электрофореза столбики полиакриламидного геля быстро извлё1сают из стеклянных трубочек. Часть столбиков геля окрашивают на белок 0,2% раствором кумасси бриллиантового голубого R-250 в 7% растворе уксусной кислоты (можно использовать и другие красители, например амидочерный) другую часть столбиков геля используют для выявления ферментативных активностей кислой а-глюкозидазы методом контактных пленок. Для этого гели полиакриламида помещают в желобки гофрированной пластмассовой [c.110]

Известен другой количественный метод определения активности рестриктаз, тоже основанный на применении иммобилизированной ДНК [229]. Однако в последнем случае используется радиоактивная ДНК заполимеризованная в полиакриламидном геле. Этот метод уступает спектрофотометрическому в универсальности, так как он применим только к частощепящим рестриктазам. Кроме того его применение связано с использованием радиоактивного субстрата. [c.130]

Метод включения клеток в полимеры различной природы имеет в настоадее время наибольшее применение как в лабораторном, так и в промышленном масштабе. Используют при этом природные полимеры (каррагинан, агар, желатину, хитозан, коллаген, различные пектины) и синтетические (полиакриламидный гель, фоточувствительные полимеры, полиуретаны, поливиниловый спирт и др.). В зависимости от их механических свойств и характера проводимого процесса полимеры могут использоваться в [c.166]

Для исследования спектра И. используют ионообменную хроматографию, гель-фильтрацию, электрофорез и изоэлектрофокусирование, а также иммунохим. методы с использованием антител. Наиб, широко используется диск-электрофорез в полиакриламидном геле. Однако применение только этого метода для поиска И. недостаточно, т. к. он не позволяет выявить генетически разл. формы ферментов, не различающиеся по заряду. В связи с этим для более полной характеристики спектра И. необходимо применять иммунохим. аиализ и сравнивать спектры И. мутантов. При выявлении И. необходимо избегать условий выделения, при к-рых возможно возникновение артефактных форм. Так, для предотвращения частичного протеолиза в процессе выделения и хранения работу часто проводят в присут. ингибиторов протеаз. При разделении мембранных ферментов необходимо максимально снижать концентрацию детергента, что позволяет избежать появления новых форм в результате образования мицелл с разным содержанием искомого мембранного фермента. Процедура выделения И. должна быть максимально сокращена по времени. [c.202]

В 1972 г. при электрофорезе глютенинов в полиакриламидном геле в присутствии ДДС-Na после восстановления дисульфидных мостиков удалось определить молекулярные массы составляющих их субъединиц [21]. Таким способом были идентифицированы 15 субъединиц с молекулярными массами от 116 000 до 133 000 Да (табл. 6Б.10). Высокомолекулярные (или агрегированные) глиадины состоят из субъединиц с массой 44 000 и 36 000 Да, причем доля первых больше [24, 167]. Впоследствии эти значения были подтверждены всеми исследованиями, в которых использовался данный метод определения молекулярных масс. Удалось выявить генетическую изменчивость состава субъединиц глютенинов [20, 33, 108, 150[. Способ выделения фракций глютенинов может изменить состав их субъединиц [20, 110[ так же, как это происходит при удалении жиров из муки [169]. [c.201]

Существуют два различных метода электрофореза фронтальный электрофорез, который проводят в свободной незакрепленной среде, и зональный электрофорез — в закрепленной среде (стабилизированная жидкость или носители). Они имеют единую аппаратурную схему источник тока, камеру для электрофореза, два электрода, соединяющих камеру с источником тока, и аппаратуру для сбора и идентификации разделенных веществ. Для электрофореза используют как готовые наборы аппаратуры (универсальный прибор для иммуноэлектрофореза и электрофореза белков на бумаге и крахмале, набор для электрофореза в полиакриламидном геле венгерской фирмы Реанал ), так и наборы, составляемые экспериментатором из отдельных приборов (универсальный источник питания УИП-1, двухлучевой регистрирующий микрофотометр ИФО-451 и др.). [c.144]

Сенжер и Коулсон создали метод анализа последовательности ДНК, который основан на ферментативном копировании однонитевых частиц ДНК [18]. Максам и Гилберт создали метод, в основу которого положена химическая модификация четырех оснований, входящих в состав ДНК, и который с одинаковым успехом применим как к однонитевым, так и к двунитевым молекулам ДНК [19]. Оба метода используют авторадиографическое определение згр-меченных олигонуклеотидов, которые разделяют в зависимости от их длины электрофорезом денатурированных фрагментов в полиакриламидном геле. На практике, успех этих методов во многом определяется недавними достижениями в энзимологии нуклеиновых кислот, особенно использованием ферментов рестрикции, расщепляющих молекулы ДНК, и обратной транскриптазы, с помощью которой получают циклические ДНК, комплиментарные РНК-матрице. Нижеследующее описание методики анализа будет, однако, предполагать наличие гомогенных образцов ДНК подходящей длины. [c.188]

Одним из наиболее распространенных методов фракционирования белков (как и методов оценки гомогенности) является диск-электрофорез (от англ. dis ontinuous-прерывистый, перемежающийся) в полиакриламидном геле, при котором используют пары буферных растворов с различными значениями pH и разной степени пористости гель. Следует отметить высокую разрешающую способность гель-электрофореза. Если при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге открываются всего 6 фракций, то при электрофорезе в крахмальном геле-10, а в полиакриламидном геле-до 18 разных белковых фракций. [c.31]

Чтобы выход продукта был достаточно высок, эффективность присоединения нуклеотидов на каждом этапе должна быть не ниже 98%. Эффективность контролируют спектрофотометрическими методами, определяя количество удаляемых тритильных групп. Если, например, при синтезе 20-членного олигонуклеотида эффективность каждого цикла равна 99%, то 82% (т. е. 0,99 100) олигонуклеотидов будут иметь именно такую длину. Если же синтезируется 60-членный олигонуьслеотид, то при той же эффективности только 55% олигонуьслеотидов будут содержать по 60 нуклеотидов. А если средняя эффективность цикла не превышает 98%, то доля олигонуклеотидов заданной длины будет гораздо ниже (табл. 5.1). Фирмы - изготовители коммерческих ДНК-синтезаторов обычно гарантируют среднее значение эффективности присоединения 98%. Но для этого необходимо использовать реагенты и химикаты очень высокой степени чистоты, что не всегда удается выполнить. Как правило, реальная эффективность присоединения составляет 95%, хотя иногда удается достичь и 99%-ной эффективности. Чтобы получить олигонуклеотиды заданной длины, первичные продукты большинства химических синтезов необходимо очистить с помощью либо высокоэффетивной жидкостной хроматографии под высоким давлением с обращенной фазой, либо электрофореза в полиакриламидном геле. Поскольку все неудачные последовательности короче, чем тот олигонуклеотид, который хотят получить, сделать это нетрудно. [c.85]

По сравнению с сильно набухающими сефадексами и полиакриламидными гелями агарозы обладают большей жесткостью и выдерживают более высокие давления. Уступая полиакриламидным гелям по разделительной способности, они в целом дают лучшие результаты, так как этот недостаток агароз можно компенсировать применением длинных колонок (за счет лучших фильтрационных свойств). Так как разные фирмы используют различные методы для выделения агарозы (отделения агаропектина от агара), продукты могут иметь различную чистоту и молекулярную массу. Эго отражается и на хроматографических характеристиках гранулированных агароз — их прочности, адсорбционной способности и т. п. В большинстве случаев гели производят в бисерной форме, но выпускают также гранульные гели с зернами произвольной формы. Поставляют гели в гидратированном состоянии, с раствором, содержащим антисептики, обычно — 0,02% азида натрия и 0,001 М ЭДТА (окончание на стр. 62). [c.57]

Области применения полиакриламидных гелей те же, что и сефадексов (см. разд. 28). Для обессоливания наиболее пригодны гели марок от Р-2 до Р-10. Гель Р-2 успешно применяют для обессоливания пептидов и нуклеотидов. Сорбционные свойства полиакриламидов используют при разделении основных белков, нуклеотидов, нуклеозидов и нуклеиновых оснований методом адсорбцион ной хроматографии (В о п i 11 аС. А., Anal. Bio hem., 1969, v. 32, No. 3, p. 522— 529). [c.63]

Гели в качестве поддерживающей среды при электрофорезе обладают рядом важных особенностей. Главная из них та, что размеры пор геля могут быть сравнимы с размерами белковых макромолекул. В этих условиях подвижность частиц очень резко зависит от их размеров. Таким образом, вводится дополнительный фактор, влияющий на разделение. Кроме того, адсорбция во многих гелях крайне мала. Но этим причинам электрофорез в гелях обладает чрезвычайно высокой разрешающей способностью по отношению к сложным белковым смесям — значительно более высокой, чем все другие методы. Это особенно выражено в крахмальном геле, предложенном Смитисом в 1955 г., и в синтетическом полиакриламидном геле, который все чаще используют в последнее время. В этих гелях, например, удается обнаружить до 30 компонентов сыворотки крови, в то время как фронтальный электрофорез дает только 5—7. Агаровый гель хотя и обладает малой адсорбцией по отношению к белкам, дает худшее разделение, так как размер пор в нем относительно велик. Но и в агаре было замечено, что отношение подвижностей больших и малых ионов уменьшается с увеличением концентрации агара (т. е. с уменьшением размера пор). [c.95]

Наряду с основными методами существует ряд смещанных методов, среди которых дискретный электрофорез в полиакриламидном геле играет важную роль в разделении биополимеров. В этом методе сначала используются некоторые элементы изо-тахофореза, который через некоторое время заменяется на зонный электрофорез в среде геля, однако в геле могут иметь место и молекулярно-ситовые эффекты. [c.281]

Изоэлектрическое фокусирование в геле имеет определенные преимущества по сравнению с ИФ в среде со стабилизованным градиентом плотности. Эти преимущества состоят в следующем 1) сокращается длительность разделения 2) полностью подавляется термическая конвекция 3) применяется простое оборудование для ИФ 4) возможно одновременное разделение нескольких образцов 5) возможно обнаружение с помощью различных красителей и различных методик 6) возможно объединение ИФ и зонного электрофореза в двухмерном варианте 7) достаточно небольшого количества образца 8) возможно обнаружение белков методом иммунодиффузии. Однако при применении геля возникают проблемы, связанные с молекулярноситовым эффектом, который имеет место в основном при разделении больших молекул. Другой недостаток метода — это низкая точность определения pH в зонах. В настоящее время этот метод (сокращенное обозначение ИФПАА или ПАГИФ) является общепринятым и широко используется. В отдельных случаях, согласно данным [73], при проведении дискретного трубчатого электрофореза в полиакриламидном геле доо пска-ется окрашивание. Для снижения молекулярно-сито<вого эффекта рекомендуется [23] концентрация геля 3,7%. Типичный градиент напряжения для 8-часового разделения составляет 200 В на 60 мм. Если тепло отводится, то напряжение можно увеличить и соответственно сократить длительность разделения. Градиент pH можно измерить после разрезания столбиков с гелем и последующего элюирования сегментов небольшим коли- [c.323]

Взяв за основу метод Шонигера, Мак-Ивен [45] разработал метод определения радиоактивности в полиакриламидном геле с сжиганием. Несмотря на то что сжигание участков геля в автоматическом аппарате представляет собой трудоемкую процедуру, этот метод используют в некоторых лабораториях. Во всяком слу- [c.144]

Детектирование изотопа на электрофоретограммах методом авторадиографии также не эффективно, как в ТСХ и БХ. Обычно для этого лучше использовать жидкостный сцинтилляционный счет. В связи с тем что этот метод является разрушающим и отнимает много аремени, Боннер и Лески [48] применили для детектирования в полиакриламидном геле методы флюорографии, которые раньше использовались в хроматографии (гл. 4). [c.146]