Сортер

Рис. 1У-38. Многокамерный классификатор Супер Сортер .

Выделение клеток с флуоресцентными активированными клеточными сортерами (ФАКС) требует дорогостоящего оборудования и малопригодно для рутинных экспериментов, особенно при необходимости получения большого числа клеток. Следовательно, существует необходимость в более широко доступных и воспроизводимых методах разделения клеток. Аффинная хроматография в принципе представляет собой идеальный метод для очистки клеток он заключается в иммобилизации на твердых носителях лигандов, избирательно узнающих компоненты мембран. [c.243]

Несколько Компаний участвуют в настоящее время в производстве та кого оборудования, которое можно разделить на две главные группы аналитические устройства, предназначенные для измерения рассеяния, поглощения и флуоресценции, и клеточные сортеры, предназначенные для разделения клеток по определенным свойствам. [c.184]

Имеется также тест-система, позволяющая видеть центральный, левый и правый токи капель. Эта система позволяет проверять стабильность сортера. [c.189]

Тематический спектр данной монографии очень широк. Это и технология получения и применения рекомбинантных ДНК, и описание высокоразрешающих и чувствительных методик обнаружения и фракционирования белков, и различные примеры использования моноклональных антител, и характеристика методов фракционирования клеток (включая фракционирование на клеточном сортере), и описание манипуляций с некоторыми особо интересными для иммунологов видами животных и их зародышами. [c.5]

Анализ на флуоресцентном сортере [c.177]

II. ОПИСАНИЕ КЛЕТОЧНОГО СОРТЕРА [c.327]

После усиления сигналы, полученные от клетки, сравнивают с заданными параметрами, чтобы определить, является ли регистрируемое событие тем, которое нас интересует. Процесс, с помощью которого мы отбираем интересующее нас событие, называют дискриминацией, а ограничения, накладываемые на регистрируемый параметр,— окнами. Правильный выбор параметров дискриминации или окон является критическим для адекватного использования клеточного сортера (разд. VI,А). Включение определенных субпопуляций в анализ и исключение их из него могут существенно влиять на результаты. [c.330]

После того как проанализированы данные о клетке и принято решение о том, как она будет дискриминироваться, ее помещают в нейтральную каплю или в каплю, которой придается положительный или отрицательный заряд. Капля проходит между противоположно заряженными электродами, к которым подведено высокое напряжение, и отклоняется вправо или влево в зависимости от своего заряда. Наконечник форсунки колеблется с высокой частотой, благодаря чему поток разбивается на капли. Точка отрыва капель, однако, находится на значительном расстоянии от точки, в которой производится измерение, и именно в точке отрыва капле придается заряд. Поэтому между моментом измерения и моментом придания заряда капле имеется определенная задержка. Продолжительность задержки можно определить и затем ввести эту информацию в сортер. Тем не менее определенная доля клеток будет попадать в предшествующую и последующую по отношению к расчетной капли. Для того чтобы увеличить выход сортируемых клеток, обычно отбирают (т. е. отклоняют с помощью электродов) не одну, а несколько капель (мы обычно используем три) на каждую отбираемую клетку. [c.330]

Этот метод особенно удобен при работе с небольшими количествами клеток. Окрашивание проводят в лунках панелей для микротитрования и, если сортер не имеет приспособлений для отбора проб из лунок, клетки в конце процедуры переносят в пробирки. Описание этого метода приведено в гл. 10. [c.336]

Основное различие между работой на цитометре в аналитическом режиме и на сортере состоит в том, что во втором случае ставится задача сбора проанализированных клеток. При этом обычно исследуют (и соответственно готовят для анализа) гораздо большие количества клеток, чем для работы в аналитическом режиме. [c.337]

В одной из схем В-лимфоциты человека, активно продуцирующие специфические антитела, обработали флуоресцентно меченным антигеном, затем с помощью клеточного сортера провели обогащение образца В-лимфоцитами, вырабатывающими эти антитела. Поскольку В-клетки плохо растут в культуре, для улучшения роста их трансформировали вирусом Эпштейна-Барр. Некоторые клоны трансформированных В-кле- [c.214]

Сортировка X- и Т-хромосом. В работе [333, 330] осуществлена препаративная проточная цитофотометрия X- и У-хромосом человека. Х-хромосома была выделена из клеточной линии с кариотипом 48,ХХХХ с помощью однолучевой сортировки. Этот материал был использован для приготовления библиотеки хромосомной ДНК после обработки рестриктазой ЕсоК1 и клонирования в фаге (см. разд. 2.3,2,2), У-хромосома отобрана с помощью двулучевого сортера из материала гибридной клеточной линии китайский хомячок X человек . Получение клеточных гибридов будет описано в разд, 3,4,3 в связи с локализацией генов в хромосомах. Важная особенность гибридных клеток человек х мышь или [c.132]

Отдельные клетки также могут быть изолированы из суспензий с использованием микроманипулятора, проточного цитофлюо-риметра с сортером или путем последовательных разбавлений. В последнем методе суспензия готовится разными способами [c.28]

В роли селективного фактора могут выступать антитела. При этом мы получаем возможность выделять клетки с определенным набором антигенов клеточной поверхности [31]. Применение антител лежит в основе ряда методов, среди них отбор клеток с помощью клеточного сортера, розеткообразование с эритроцитами, связанными антителами, избирательное прикрепление клеток к поверхности с иммобилизованными на ней антителами. Хотя эффективность селекции клеток с помощью антител недостаточно высока (и более правильным было бы назвать этот метод обогащением), тем не менее селекция с использованием антител применяется во всех методах переноса генов, описываемых здесь, за исключением MMGT. [c.12]

Известно, что компетентные клетки способны включать-большое количество донорной ДНК, причем одна реципиентная клетка может включать несколько разных молекул донорной ДНК в один геномный сайт. Этот феномен позволяет выделять компетентные субпопуляции из общей массы реципиентных клеток и маркировать геном млекопитающих. Если донорная ДНК смешана с плазмидной, кодирующей селективный для клеток млекопитающих маркер, селекция по плазмидному гену после трансфекции позволяет выделить популяцию трансфицированных клеток. Такое обогащение облегчает дальнейшую очистку реципиентных клеток. Этот прием оказался успешным при клонировании генов, кодирующих клеточные поверхностные антигены. В данном случае для обогащения использовали антитела, а для разделения субпопуляций клеток флуоресцентный сортер (FA S) [46]. [c.28]

Отклоняющие пластины сортера и держатель сосудов для свора фраииии [c.185]

Аналоговые сигналы, производимые двумя ФЭУ (например, данные по светорассеянию и флуоресценции), собираются в осциллоскопе с памятью и представляются на его экране в виде двумерного графика, где каждая клетка представлена одной точкой (рис. 6.7, нижняя часть). Фокусы плотности на этих гистограммах могут представлять кластеры интересующих клеток, и могут быть задействованы пороговые системы для подсчета числа 1клеток или для запускания клеточного сортера, отбирающего клетки из интересующих областей дисплея. [c.195]

Суспензии других клеток Иммунофлуоресценция и иммуноферментные методы прямые или с использованием меченого антиглобулииа (кн. 2), Комплемент-зависимая цитотоксичность с использованием красителя или Сг. Иммунофлуоресценция лучше — с использованием клеточного сортера. Антисыворотку проверяют на способность тормозить связывание меченого контрольного конъюгата (кн. 2). [c.96]

Как уже упоминалось, каждая антигенная система требует своего особого метода накопления соответствующих В-клеток. Метод накопления нужных В-клеток с помощью розетирования мы уже обсуждали в связи с получением МКА к антигену RhD. Данный метод вполне пригоден и для получения МКА к другим групповым антигенам крови. Для получения МКА к столбнячному анатоксину был описан другой прием использовали антиген, конъюгированный с флуоресцеином, и затем выделяли связавшие метку клетки с помощью флуоресцентного сортера [16]. Если возникнет необходимость, у исследователей хватит изобретательности, чтобы разработать способ выделения В-клеток, специфичных к любой антигенной детерминанте. [c.163]

ИФМ имеет ряд существенных преимуществ перед цитоток-сическими тестами, ELISA и РИА. Во-первых, с помощью ИФМ можно определять молекулы, присутствующие на клеточных поверхностях с плотностью до нескольких тысяч копий на клетку. Во многих случаях, когда методы ELISA на клеточных поверхностях, цитотоксические тесты или РИА оказываются недостаточно чувствительными, антигены плазматической мембраны удается определить с помощью ИФМ. Во-вторых, при исследовании ИФМ имеется возможность достаточно просто детектировать антитела практически всех классов иммуноглобулинов. Например, в настоящее время имеется несколько видов мышиных МА против каппа-легких цепей иммуноглобулинов крыс. Поскольку от 90 до 95% всех иммуноглобулинов крыс содержат каппа-легкую цепь, эти МА существенно улучшают возможности скрининга. В отличие от этого в цитотоксических тестах желательно, чтобы МА принадлежали к классу IgM, так как при этом фиксация комплемента обеспечивается с наибольшей эффективностью. В-третьих, при проведении ИФМ на проточном флуорометрическом клеточном сортере (ПФКС) для каждого определения связывания антител анализируется большое число клеток. Если для каждого образца имеется возможность просчитывать 5—10-10 клеток, то значительно уменьшается вероятность ошибок. [c.179]

Флуорохромы можно присоединять непосредственно к моноклональным антителам, или, как это делается чаще всего, можно пометить вторичный реагент для непрямого выявления антител, такой, например, как белок А из Staphylo o us aureus или антитела против иммуноглобулинов. Флуоресцентное окрашивание дает существенную информацию о распределении антигена в смешанных клеточных популяциях, однако наблюдения в микроскоп занимают много времени и их интерпретация не всегда объективна. К тому же флуоресцентный клеточный сортер не всегда доступен, и работа на нем обычно требует предварительных заявок и планирования. [c.218]

Используя те же клетки, можно начинать культивирование с клонирования одиночных клеток или проводить анализ методом лимитирующего разведения. В ряде случаев популяцию предшественников В-клеток обогащают или даже выделяют их в чистом виде с помощью положительной селекции, применяя моноклональные антитела к антигенам В-220, АА4.1 или GF1.2. При этом используют методики адсорбции на чашках (пен-нинг), образования розеток или применяют флуоресцентный клеточный сортер. Одиночные клетки можно поместить с помощью микроманипуляций в круглодонные лунки микропанелей и культивировать их в 200 мкл WEHI-K или в присутствии очищенного ИЛ-3. При этом среду меняют каждые 3 ср и положительные культуры размножают в лунках панелей Limbro и во флаконах для тканевых культур. [c.310]

Набор оборудования, входящего в комплект клеточного сор-тера, варьирует от прибора к прибору. Мы работаем в основном на приборе FA SII (Be ton Di kinson, США), снабженном компьютером, и эта глава написана с учетом именно этого прибора. Вместе с тем представленная в главе информация будет полезна всем, кто работает на подобных приборах, независимо от конкретного типа клеточного сортера. [c.327]

На рис. 20-1 показана схема флуоресцентного клеточного сортера, который устроен примерно так же, как FA S II. В приборе можно выделить три основных блока 1) оптическую скамью, где производят измерения (и разделение) 2) блок обработки сигналов, где сигналы усиливаются и обрабатываются, принимаются решения об отнесении клетки к той или иной популяции при сортинге и сигналы переводятся в цифровую форму 3) блок сбора и обработки данных (например, компьютер). [c.327]

Рис. 20-1. Схема снабженного компьютером флуоресцентного клеточного сортера, аналогичного по конструкции прибору FA S II.

После выбора окна сортер может производить два действия сортировать клетки и хранить данные о популяции клеток. В случае сортинга можно установить окна для двух субпопуляций клеток. Один набор параметров дискриминации будет приводить к сортировке клетки налево, а другой — направо. Клетки, параметры которых не подходят ни к одному из окон или слишком сходны для дискриминации, не сортируются. Руководит этими решениями блок обработки сигналов, который подает на оптическую скамью приказы о том, куда направить клетку. Вторая функция, которую осуществляет блок обработки сигналов, — это посылка данных в блок хранения. [c.330]

Одна из наиболее трудных проблем при цитометрии связана с неспецифическим окрашиванием. Клеточный сортер с чрезвычайно высокой чувствительностью детектирует флуоресцирующие молекулы — обычно с большей, чем глаз. Поэтому реагенты, используемые при работе с сортером, должны быть более высокой степени очистки, чем для других методов анализа. Как правило, гетерологичные сыворотки должны подвергаться очистке на аффинных сорбентах даже в тех случаях, когда они достаточно специфичны для непосредственного использования при флуоресцентной микроскопии. Моноклональные антитела не всегда требуют очистки. Мы с успехом использовали супернатанты многих продуцирующих моноклональные антитела гибридом, которые культивировали в средах с добавлением и без добавления сыворотки, а также асцитные жидкости (конечно, в соответствующем разведении). В случае непрямых методов флуоресцентного окрашивания влияние контаминирую-щих молекул в культуральных жидкостях сводится к минимуму. Если конъюгированные с флуорохромом антитела строго специфичны по отношению к иммуноглобулинам, то даже при связывании клетками молекул, не относящихся к иммуноглобулинам, эти молекулы не будут детектироваться (по флуоресценции). В случае применения асцитных жидкостей активность моноклональных антител обычно настолько высока, что эффекты контаминирующих иммуноглобулинов и других компонентов чаще всего не выявляются. Однако при прямом конъ-югировании препаратов антител с флуорохромом наличие в них белковых примесей неиммуноглобулиновой природы может стать причиной высокого уровня неспецифического окрашивания. Следовательно, любой конъюгат используемый при сортинге клеток, должен быть тщательно очищен. [c.332]

Большинство клеточных сортеров снабжено приспособлениями для поддержания постоянной температуры, высокой или низкой. Какая бы ни была температура, главное, чтобы ее хорошо переносили клетки. Окрашенные клетки, которые могут терять свой антиген, следует разделять на холоду. Когда нам приходится использовать маленькие пробирки (пробирки Fal on 2052 на 4 мл), мы замораживаем приблизительно по 1 мл среды на дне пробирки, помещая ее в сухой лед. Замерзшая среда тает при сборе клеток, благодаря чему поддерживается низкая температура. [c.338]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология