Иммуноаффинная хроматография антигена

В случае хранения в замороженном состоянии при —20 °С рекомендуется разделять антисыворотку на партии небольших объемов, чтобы не подвергать ее многократному замораживанию и размораживанию. При использовании некоторых методов необходимо, чтобы иммуноглобулины IgG были отделены от других сывороточных белков. Осаждение сульфатом аммония или комбинирование этой операции с ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе [31, 36] или с аффинной хроматографией при использовании белка А, иммобилизованного на носителе [48], позволяет легко, но более или менее тщательно очистить эти иммуноглобулины. Иммуноаффинная хроматография, используя очищенный иммобилизованный антиген, дает возможность производить очистку специфических антител белка при разделении фракции IgG или даже антисыворотки. [c.97]

В том случае, когда количество исследуемого антигена достаточно только для первоначальной иммунизации, используют другой вариант иммуноаффинной хроматографии, разработанный сравнительно недавно. Полученные антитела иммобилизуют на нерастворимом носителе и экстракт, содержащий антиген, наносят на колонку. Десорбцию осуществляют обычным способом. Однако при приготовлении сорбента, сорбции и элюировании необходимо иметь в виду высокую лабильность антител в присутствии денатурирующих агентов. [c.188]

Необратимость взаимодействия клеток с аффинным носителем хотя адсорбция клеток на специфических иммобилизованных лигандах зачастую достигается легко, постоянно возникали трудности при последующем выделении связавшихся клеток с применением методов, совместимых с жизнеспособностью клеток. Одна из причин этих трудностей — многоточечное связывание между клеткой и носителем каждая клетка обладает многочисленными рецепторами для иммобилизованного лиганда, причем несколько молекул лиганда сами связаны с одной и той же частицей матрицы или поверхности. Второй причиной необратимого связывания клеток с аффинным носителем может быть очень высокое сродство между иммобилизованным лигандом и его рецептором на поверхности клетки, которое часто возникает, если узнавание клетки и лиганда основано на взаимодействии антиген — антитело это весьма серьезное ограничение при выделении жизнеспособных клеток иммуноаффинной хроматографией. [c.247]

Как это детально показано в разд. 6.3, антитела проявляют высокое сродство соответствующим антигенам и наоборот. Трудности их освобождения из комплексов 0бусл0 Влены именно этим сильным взаимодействием. Использования сильных хаотропных элюентов в иммуноаффинной хроматографии можно избежать путем химической модификации иммобилизованных аффинных лигандов [39]. Например, элюирование антиглюкагоновых антител из колонки с иммобилизованным глюкагоном может быть осуществлено в мягких условиях, если частично нарушить пространственную комплементарность к связывающему участку антитела путем избирательной модификации гормона, например реакцией с 2-окси-5-нитробензилбромидом, тетранитрометаном или перекисью водорода. [c.107]

Для HBV разработано несколько методов получения поверхностного антигена в клетках эукариот. Стимулом для этих разработок послужила острая необходимость в дешевой вакцине. Хотя имеющаяся в настоящее время разрешенная вакцина против HBV, содержащая (22 нм)-поверхностный антиген гепатита В (HBsAg), который получен из плазмы хронически инфицированных носителей, защищает от заболевания, высокая стоимость препятствует ее использованию в развивающихся странах, где нужда в эффективной иммунопрофилактике особенно велика. Возможно, эта ситуация скоро будет исправлена, поскольку в настоящее время антиген HBsAg получают из дрожжей в количествах, очевидно, достаточных для его поступления в продажу. Его экспрессия достигается при трансфекции дрожжей рекомбинантом, который содержит ген поверхностного антигена HBV, встроенный в плазмиду за индуцируемым промотором [ИЗ, 186]. Продуцируемый дрожжами HBsAg, очевидно, не гликозилирован, но иммуногенен в организме шимпанзе. После разрушения дрожжевых клеток антиген очищают с помощью изопикнического и скоростного зонального центрифугирования в комбинации с иммуноаффинной хроматографией [16, 186, 189]. [c.156]

Мы пришли к выводу, что для самых разнообразных иммунологических исследований необходимо получать максимально возможное количество нативного белка. Это легче всего достигается с помощью классических хроматографических методов, детально описанных в разд. 5.3.3.3, которые наиболее успешно работают при использовании экспрессирующих систем на основе плазмид pUR. Другие методы применяют, когда возникают сложности с выходом, растворимостью или стабильностью гибридного белка. Например, к выделению гибридных белков методом ДСН-электрофореза в ПААГ следует прибегать в последнюю очередь, а не использовать его сразу из-за его простоты, поскольку денатурированные ДСН белки меняют свои иммуно-генные свойства и с их помощью не всегда удается получить антисыворотку к нативному белку. Если антисыворотка в основном будет использоваться в вестерн-блот-анализе, то в этом случае денатурированные под действием ДСН иммуногены могут оказаться пригодными. Иммуноаффинные методы очистки можно эффективно использовать в ограниченном масштабе, поскольку, к сожалению, элюируемые белки, как правило, необратимо денатурированы реагентами, используемыми для разрушения комплексов антиген—антитело. С помощью хроматографии на АФТГ-агарозе можно получить чистый растворимый белок, но метод не очень эффективен и дает очень низкий выход белков, содержащихся в клетке в небольшом количестве или обладающих низкой стабильностью. Выбор того или иного метода поможет сделать анализ результатов прикидочного выделения и очистки. [c.155]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология