Гель-фильтрация сефароза

При определении молекулярной массы с помощью гель-фильтрации [70, 73] применяют сефадексы различного типа (0-50, 0-100, 0-150, 0-200), агарозы (сефарозы 2В, 4В, 6В) или полиакриламиды (биогели Р-100, Р-150, Р-300). Процесс проводят как в хроматографических колонках, так и на тонкослойных пластинках. Принцип метода уже рассматривался в разд. 3.3. [c.361]

Антитела в бикарбонатном буфере можно прямо смешать с сефарозой, активированной бромцианом (10 мл белка в 1 мл геля), или же очищать дальше с помощью гель-фильтрации нлн ионообменной хроматографии. [c.51]

Полученные так суммарные препараты нуклеиновых кислот фракционируют далее, используя более тонкие методы, такие, как хроматография, в том числе аффинная, фильтрация через гели агарозы и сефарозы, распределение в двухфазных полимерных системах, ультрацентрифугирование, электрофорез и др. Большинство этих методов рассмотрено в гл. II и при работе с нуклеиновыми кислотами отличается лишь в деталях. В итоге получают препараты индивидуальных нуклеиновых кислот. [c.190]

Биогели серии А. Американская фирма Bio-Rad выпускает агарозные матрицы для гель-фильтрации под торговым наименованием Bio-Gel А . Нет нужды останавливаться на свойствах этих матриц — они аналогичны тем, что были описаны для сефарозы. Ниже представлены параметры шести тппов этих матриц. [c.120]

Сочетая фракционное осаждение экстракта муки, солюбилизированной в 1,5 %-ном растворе ДДС-Na, с гель-фильтрацией на сефадексе G 100 или сефарозе L 4В, удалось выделить 7 фракций, которые различаются между собой молекулярными массами и степенью растворимости [84]. [c.200]

Персон и соавторы отделяли гель-фильтрацией гибрид ДНК— РНК от не включившейся в него РНК. В качестве низкомолекулярного партнера фигурировала суммарная РНК из клеток HeLa, зараженных аденовирусом. Ее гибридизовали с высокомолекулярной ДНК аденовируса. Естественно, что в этом случае для отделения РНК пришлось использовать весьма крупнопористый гель — сефарозу 2В. Колонка размером 0,9 X 20 см была уравновешена и элюировалась 0,05 IVi Трис-НС1, pH 7,9, содержавшим 0,5 1VI Li l, 0,5% ДДС-Na и 1 мМ ЭДТА. Препараты вносили прямо в гибриди- [c.144]

Следует подчеркнуть, что большинство препаратов иммуноглобулина определенного класса обычно содержит примеси Ig других классов, за исключением IgG, выделенных хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, и IgM, выходящих в первом пике при хроматографии на сефадексе G-200. Поэтому рекомендуется проводить рехроматографию полученных препаратов на той же колонке и в тех же условиях, либо использовать какую-то иную процедуру, например электрофорез в агарозном блоке или гель-фильтрацию. Для той же цели можно применить и аффинную хроматографию на сефарозе с класс-специфической антисывороткой. Миеломные белки классов G, А и М и парапротеины при макроглобулинемии Вальденстрёма удается очистить одноэтапной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе или зональным электрофорезом, поскольку они являются основным компонентом сыворотки. Чистоту каждой фракции иммуноглобулинов исследуют с помощью иммуноэлектрофореза, двойной иммунодиффузии или радиоиммунным методом с класс- или подкласс-специфическими антисывороткамн. Чистые белки хранят при 4°С в присутствии 0,02% NaNs или замораживают растворы с концентрацией 10— 30 мг/мл. [c.72]

При изучении свойств НАД-киназы из скелетных мышц использовали высокоочищенные, но ие гомогенные препараты НАД-киназы. Препарат фермента из сердца голубя был электро-форетически получен в гомогенном состоянии. Метод выделения и очистки в качестве последних стадий включал ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-сефадексе А-50 и гель-фильтрацию на сефарозе 6В [5]. Сравнение свойств частично очищенных и гомогенных, по данным электрофореза, препаратов фермента позволило установить следующую закономерность. Частично очищенные ферментные препараты НАД-киназы из сердца голубя подобно ферменту из скелетных мышц кролика гетероген ны и представлены не менее чем пятью молекулярными формами, число которых могло варьировать от препарата к препарату НАД-киназную активность проявляли формы с молекулярными весами, равными 300 000—270 000, 230 000—200 000, 180 000, 120 000 и 45 000. Из распределения общей активности фермента между различными молекулярными формами следует, что большая часть НАД-киназы представлена олигомерами с молекулярным весом 180000. [c.138]

В противоположность частично очищенному препарату гомогенная по данным электрофореза НАД-киназа из сердца голубя утрачивает способность к ассоциации — диссоциации. При гель-фильтрации такого препарата через колонку с сефарозой 6В НАД- [c.139]

Тирозин — аминотрансферазу выделяли методом аффинной хроматографии на пиридоксаминфосфатагарозе (сефарозе 4В) [61]. Фермент элюировали, изменяя состав буферного раствора. Препарат, прошедший на этой стадии 125-кратную очистку, подвергали далее гель-фильтрации на сефадексе G-200. ь-Тирозин-2-оксоглутарат—аминотрансфераза была выделена в виде смеси нескольких изоферментов. [c.19]

После экстракции белков из муки смесью УМЦ Хюбнер и Уолл [99] фракционировали невосстановленные глютенины гель-фильтрацией на сефарозе 4В и сефарозе 2В в среде 5,5М гуанидинхлорида модифицированным методом Мередита и Рена [135]. Глютенины разделялись в этих условиях на две большие группы, вероятно, весьма существенно различающиеся размерами молекул, поскольку одна из них исключена из обоих типов геля (приблизительная граница исключения носителя сефароза 2В составляет 20 млн.). [c.199]

Для достижения наивысшего разрешения необходимо, чтобы свободный объем хроматографического слоя находился в равновесии с внутренним объемом гранул. При гель-фильтрации смесей веществ с приблизительно одинаковыми размерами молекул это возможно только при очень низких скоростях потока. Таким образом, при установлснпи скорости потока необходимо учитывать время разделения и разрешающую способность. В аналитической работе основная роль принадлежит разрешению, тогда как в препаративных опытах важнее быстрота разделения. При гель-фильтрации на сефарозах используется скорость от 2 до 8 мл/см7мин, при обессоливании на сефадексе 0-15 хорошие результаты получают при скорости 12 мл/см /мин, а при разделении на сефадексе 0-200 скорость может составлять от 5 до 20 мл/см /мин. [c.232]

Эти ионообменники получают на основе носителей для гель-фильтрации - поперечно-сшитых декстранов (сефадекс) или агароз (сефароза СЬ, биогель А). Они обладают свойствами ионообменников и гель-фильтрующих материалов и гораздо меньшей обменной емкостью к молекулам, превышающим по своим размерам предел эксклюзии ионообменника в условиях эксперимента. Из-за наличия заряженных групп степень набухания таких смол и, следовательно, предел эксклюзии варьируют в зависимости от pH и ионной силы (нехарактерным для гель-фильтрующих материалов образом). [c.437]

Для одностадийного выделения высокомолекулярной ДНК из ядер, лизированных гуанидинхлоргидратом, рекомендуют гель-фильтрацию на сефадексе G-150 [29]. Описано также выделение ДНК животных [30] и трансформирующей ДНК бактерий [31] при помощи сефарозы 4 В (в 0,01 М растворе цитрата натрия, содержащем 2 М Na l (рис. 38.1)). [c.67]

Для сорбции лучше всего образец выделяемого вещества растворять непосредственно в буфере, из которого будет производиться сорбция, и, если необходимо, проводить замену состава солей, присутствующих в образце, с помощью диализа или гель-фильтрации. Если вещество, образующее в данных условиях прочный комплекс с иммобилизованным аффинным лигандом, выделяют колоночной хроматографией, то объем образца, вводимого в колонку, может быть любым. Однако, если выделяют аффинной хроматографией вещество с низким сродством к связанному аффинному лиганду, объем наносимого образца не должен превышать 5% удерживаемого объема, для того чтобы предотвратить элюирование выделяемого вещества неадсорбированным материалом. Если выделяют вещество с низким сродством к связанному аффинному лиганду, его элюирование с колонки происходит часто даже без замены буфера. В этом случае выделяемое вещество получают в разбавленном растворе. Для иллюстрации сказанного можно сопоставить хроматографию химотрипсина на сефарозе с присоединенным метиловым эфиром е-аминокапронил-О-триптофана с хроматографией этого же вещества на сефарозе с непосредственно связанным метиловым эфиром О-триитофаиа (рис. 5.4) [8]. Для элюирования химотриисина с нерастворимого носителя, на котором ингибитор укреплен через е-аминокапроновую кислоту в качестве прострапственной группы, необходимо изменение pH, при этом фракция химотрипсина элюируется в виде острого пика. Если ингибитор присоединен непосредственно к нерастворимому носителю, его пространственная доступность понижена, и химотрипсин только замедляет свое движение через колонку. Фермент элюируется в значительно большем объеме, при том же pH, в непосредственной близости к неактивному материалу. [c.264]

Аполкпопротеин Е — эукариотический полипептид, синтезируемый в клетках Е. oli, где он находится в нерастворимом состоянии, но его очищают с помощью аффинной хроматографии в присутствии денатурирующих агентов [32] (табл. 4.20). Для этого используют хроматографию на гепарин-сефарозе с 2 М мочевиной. В этих условиях эукариотический белок, чтобы узнавать лиганд, должен частично принять нативную конформацию. Далее используются еще две стадии очистки, одна из которых — это гель-фильтрация на сефакриле S-300 в присутствии 6 М гуанидинхлорида. Затем после диализа, при котором белок ренатурирует, осуществляется конечная стадия очистки с исполь- [c.124]

В настоящее время применяют ряд усовершенствованных методов разделения нуклеиновых кислот на фракции из суммарного препарата, полученного описанным методом. Это прежде всего хроматография на геле фосфата кальция, ионообменная хроматография (в качестве адсорбентов используют ДЭАЭ-целлюлозу, ДЭЛЭ-сефадекс и др.), ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы, хроматография по сродству на белковых носителях, фильтрация через гели агарозы и сефарозы, гель-электрофорез и др. [c.97]

Гель-фильтрация. Общие принципы гель-фильтрации нативных белков рассмотрены в разд. 1.2.2 хроматография в денатурирующих условиях не имеет существенных особенностей. В присутствии денатурирующих агентов (гуанидингидрохлорид, мочевина, ДСН) меняется конформация белковых молекул, что часто приводит к увеличению гидродинамического объема. Поскольку разделение идет по размерам молекул, меняются диапазон молекулярных масс, а также градуировочный график для конкретного геля. Например, в неденатурирующих условиях на сефарозе СЬ-6В можно разделить белки с М 10" —4-10 в денатурирующих условиях в присутствии гуанидиигидрохлорида диапазон молекулярных масс составляет 3000—80 000 [8]. [c.32]

В некоторых случаях мы наблюдали утечку МКА с колонки при элюировании антигена. При этом МКА и антиген после элюирования отделялись друг от друга с помощью гель-фильт-рации. Иногда вместо гель-фильтрации элюат пропускали через аффинную колонку с антииммуноглобулиновыми антителами. В последнее время мы используем антитела, присоединенные к сефарозе L-4B, и совсем не наблюдаем утечки антител, вероятно, благодаря применению перекрестносшитого геля агарозы. Вообще в нашей практике утечка антител никогда не была серьезной проблемой. [c.180]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология