Трансфекция временная

Процедура временной трансфекции приведена в табл. 9.1. Детальное описание кальций-фосфатного метода трансфекции можно найти в гл. 15 тома II данной серии [34]. Титр вируса, полученного таким путем, зависит от всех параметров, в норме оказывающих влияние на эффективность трансфекции (чистота используемой ДНК, собственная восприимчивость клеток к этой ДНК и т. п.), а также от свойств конкретной векторной системы. Некоторые ретровирусные -конструкции воспроизводимо [c.288]

Таблица 9.1. Получение вирусных препаратов путем временной трансфекции ДНК в упаковывающие клетки

С появлением генетической инженерии методология введения молекул ДНК в клетки млекопитающих привлекла внимание многих исследователей. К этому времени уже бьш разработан ряд методов трансфекции культивируемых клеток животных нуклеиновыми кислотами различных вирусов. [c.332]

Как мы уже отмечали, при работе с животными клетками используют два типа векторов. В некоторых случаях ОНИ аналогичны бактериальным плазмидам или фаговым векторам. После трансфекции или инфицирования эти векторы реплицируются и сохраняются в виде независимых внехромосомных геномов или упаковываются в инфекционные вирусные частицы. В других случаях векторы не способны реплицироваться и используются для введения специфических сегментов ДНК в клетки с целью изучения временной экспрессии клонированного гена или получения стабильной трансформации при встраивании вектора в геном хозяина. [c.260]

Поскольку все описанные на сегодняшний день упаковывающие MLV-клетки ведут свое начало либо от линий NIH3T3 либо от линии BALB/ ЗТЗ, рекомбинантную ретровирусную ДНК в них можно легко ввести путем трансфекции, используя стандартный метод кальций-фосфатной преципитации 34]. Непродолжительная, так называемая временная (transient), трансфекция может оказаться достаточной, чтобы получить вирусный препарат с низким титром (обычно 10—Ю /мл). Однако для достижения более высоких концентраций вируса необходимы стабильно трансформированные клеточные линии, экспрессирующие доминантный селективный маркер. Такие линии позволяют получать препараты вируса с титром Ю —10 инфекционных ед./мл. Титр вирусных препаратов, полученных путем временной трансфекции, можно повысить, если использовать гибридный ретровирусный вектор, содержащий полную область ранних генов вируса полиомы такая конструкция претерпевает в упаковывающих клетках мультикопийную внехромосомную репликацию [35]. [c.288]

В литературе описано множество методов выделения хромосом из клеток, блокированных в метафазе. Процедуры очистки тоже разнообразны. Одни из них позволяют получить высо-коочищенные препараты, другие—грубую фракцию хромосом, загрязненную разными компонентами клетки. Мы предпочитаем использовать для проведения трансфекции именно такие грубые препараты, во-первых, потому что их получение занимает мало времени, а во-вторых, потому что хромосомы при этом оказываются наименее разрушенными. [c.25]

Необходимо отметить, что следить за количеством и качеством доставленного внутрь клеток вектора обязательно только при разработке методики переноса гена посредством ДНК (DMGT). Наиболее важно оценить выживаемость протопластов, после трансфекции и, разумеется, наблюдать за экспрессией интернализованной ДНК. Общая стратегия заключается в определении условий, которые обеспечивают эффективное поглощение недеградированной ДНК и высокую выживаемость протопластов, а затем в анализе временной экспрессии векторной ДНК в популяции протопластов через несколько дней после обработки ПЭГ. Как только экспрессия маркерных генов будет оптимизирована, появится потенциальная возможность селекции отдельных трансформированных колоний. [c.212]

С помощью электропорации были получены стабильно трансформированные растения или клеточные линии некоторых видов растений. К йх числу относятся табак [38], морковь [22] и кукуруза [13]. Шиллито с соавторами [38] использовал вектор, содержащий доминантный селективный маркерный ген (npt-ll), который ранее успешно применяли в экспериментах по пере носу генов с помощью ПЭГ [31]. Эту плазмиду вводили с помощью электропорации в протопласты табака и отбирали трансформанты на основе резистентности к канамицину. Дан<-ные исследования, очевидно, отнимают больше времени, чем эксперименты по временной экспрессии, но в конечном итоге позволяют разработать методику стабильной трансформации. В настоящее время при использовании методов электропорации частота трансформированных колоний может достигать 2%. что более эффективно, чем трансфекция ДНК с помощью ПЭГ. Пути интеграции перенесенной ДНК такие же, как и при иС пользовании ПЭГ, и в обоих случаях перенесенные гены наследуются в соответствии с нормальными менделевскими соотношениями. [c.216]

Метод трансфекции клеток, основанный на использовании ДЭАЭ-декстрана, является альтернативой рассмотренному выше кальций-фосфатному методу [220]. Этот подход широко используется для получения клеточных линий, временно экспрессирующих рекомбинантные гены. ДЭАЭ-декстран смешивают с ДНК в питательной среде с низким содержанием сыворотки, и смесь на некоторое время добавляют к культивируемым клеткам. Комплексы ДНК с ДЭАЭ-декстраном сорбируются на поверхности клеток и поступают внутрь с помощью эндоцитоза. Доставку [c.152]

Для получения липоплексов катионные липиды и ДНК смешивают в бессывороточной питательной среде, поскольку сыворотка препятствует их объединению, и культивируемые клетки кратковременно инкубируют в их присутствии. Метод позволяет осуществлять как временную, так и постоянную трансфекцию с образованием стабильных клеточных линий. По сравнению с ДЭАЭ-декстраном эффективность этих методов, по крайней мере, в 5-100 раз выше при получении временной трансфекции и в 3-20 раз при создании стабильных трансфектантов. При этом с помощью липосом удается осуществлять трансфекцию в сложных случаях тех клеточных линий, которые не поддаются введению рекомбинантных ДНК другими способами. Более того, данная группа методов допускает проведение трансфекции в суспензионных культурах, не требует митотического деления клеток в омент проведения эксперимента и, как правило, высоковоспроизводима. [c.153]

Получение временной экспрессии генов в клетках OS часто используется для быстрой наработки рекомбинантных белков и ДНК. При конструировании клеток OS клетки зеленой мартышки V-1 были трансформированы вирусом SV40 с дефектной областью начала репликации. В результате были получены три линии клеток ( 0S-1, 2 и 7), конститутивно экспрессирующих большой Т-антиген вируса. После проведения трансфекции клеток экспрессирующими плазмидами, содержащими область начала репликации вируса SV40, последняя эффективно взаимодействует с эн- [c.180]

Число копий плазмид, введенных в клетки OS, достигает максимума через -48 ч после трансфекции. Далее внутриклеточный уровень плазмидной ДНК начинает постепенно снижаться из-за ее цитопатического действия и гибели клеток. В результате системы, основанные на клетках OS, не могут быть использованы для крупномасштабной наработки рекомбинантных белков в течение длительного времени. Максимальное внутриклеточное содержание рекомбинантных белков в этих системах наблюдают через 72 ч после трансфекции, и их синтез продолжается в течение последующих 5-10 дней на фоне медленного снижения количества клеток в культуре, что позволяет все же использовать клетки OS для препаративного синтеза рекомбинантных белков. Для этого одновременно трансфецируют до 10 клеток, выращивают их на роллерах или микроносителях, проводя многократный сбор культуральной жидкости. Такой подход позволяет получать до нескольких миллиграммов рекомбинантного белка из вышеописанного пула трансформированных клеток. [c.181]

Во всех проведенных к настоящему времени опытах промотор ТК исследовали в отсутствие 1ЕРЗ. Участвуют ли какие-то другие элементы в активации транскрипции под действием этого белка По-видимому, на этот вопрос следует ответить отрицательно, поскольку опыты по трансфекции с использованием таких же мутантов, как и при идентификации элементов промотора, показывают, что для активации транскрипции с участием IEP3 in vivo нужна только область между парой оснований [c.60]

Б. Гибридный ген /oi-глобин содержит все обычные регуляторнк элементы гена -fos, включая и SRE, и тем не менее его мРИ присутствует в начальный момент времени (через 24 ч поо трансфекции, но до введения сыворотки) и ее количество увеличивается соответствующим образом после введения сьщ ротки. Можете ли вы объяснить это на основании стабильной мРНК i [c.184]

До недавнего времени при введении молекул ДНК в клетки млекопитающих наиболее часто использовали кальций-фосфатный и ДЭАЭ-декстрановый методы, так как они достаточно просты и обеспечивают высоковоспроизводимые результаты. Однако активно ведутся поиски других, более простых и эффективных методов трансфекции вирусными ДНК. [c.334]

Для введения таких молекул ДНК в клетки млекопитающих прежде всего были опробованы методы, ранее разработанные для трансфекции клеток вирусными нуклеиновыми кислотами. Как и ожидалось, они оказались пригодными и в этих случаях. До недавнего времени кольцевые плазмиды и линейные фрагменты ДНК в клетки животных в основном вводили кальций-фосфатным и ДЭЛЭ-декстрановым методами. Когда необходимо осуществить генетическую трансформацию, т. е. интегрировать фрагмент ДНК в геном клетки, предпочтительнее использовать кальций-фосфатный метод, так как он в этом случае обеспечивает ббльшую эффективность. Если требуется сохранить целостность вводимой кольцевой молекулы ДНК, то обычно преимущество имеет ДЭАЭ-декстрановый метод. [c.335]

Недавно у мышей удалось осуществить замену гена косвенным, достаточно трудоемким путем. Процедура сводится к следующему. Сначала фрагмент ДНК, содержащий нужный мутантный ген, вводят путем трансфекции в специальную линию плюрипотентных стволовых клеток, выделенных из эмбриона и выращиваемых в культуре. Клеткам дают возможность размножаться в течение некоторого времени, после чего методом блот-анализа по Саузерну выявляют редкие колонии, в которых общая рекомбинация привела к замене гена, и отдельные клетки из этих колоний имплантируют в ранний эмбрион мыши. В этой новой для них среде выделенные из эмбриона стволовые клетки часто пролиферируют, образуя крупные участки в теле нормальной мыши. Мышей, у которых произошла замена гена в клетках зародышевого пути, скрещивают, чтобы получить самца и самку, которые окажутся гетерозиготными по этому признаку (т. е. будут иметь одну нормальную и одну мутантную копию данного гена). Если теперь скрестить этих животньк, то одна четвертая часть их потомства будет гомозиготной по [c.339]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология