Сефароза как матрица в аффинной хроматографии

В обычной аффинной хроматографии для иммобилизации субстратов в качестве носителей используются агароза и сшитая сефароза. В качестве сшивающего агента обычно выступает ВгСМ, а мостик образован а,о)-диамином. Эти полисахаридные носители подвержены биодеградации, и, следовательно, органические полимерные гели более удобны в качестве матрицы и допускают более широкий набор химических модификаций. Именно эти причины побудили Уайт-сайдса и сотр. разработать новый метод иммобилизации ферментов в сшитых органических полимерных гелях [126]. По своей простоте и универсальности этот метод превосходит ранее предложенные. Особенно ценен он при иммобилизации относительно лабильных ферментов для использования в ферментерах большого размера при проведении реакций органического синтеза, катализируемых ферментами. [c.257]

Ситуация заметно ухудшается в том случае, когда связывание белкового лиганда с матрицей происходит не в одной, а в нескольких точках. Об этом уже упоминалось при анализе условий фиксации лигандов на Br N-активированной сефарозе довольно много было сказано и в предыдуп(ей главе. Тем не менее имеет смысл остановиться на этом вопросе еще раз — в аспекте аффинной хроматографии. Многоточечное связывание белка с матрицей может приводить как к недоступности активного участка белковой молекулы, так и к ее денатурации за счет растяжения, т. е. к потере биологической активности. [c.386]

БНФ-П<ефароза. В дополнение к лиганд-связывающей активности нейрофизинов (как описано выше), это семейство белков обладает также свойством самоассоциировать с образованием димеров из мономерных субъединиц. Это взаимодействие было изучено количественно методом аффинной хроматографии с использованием матрицы, представляющей собой бычий нейрофизин II (БНФ-П), присоединенный к сефарозе [4, 21, 22]. Сорбент БНФ-П-сефароза может быть получен в результате одностадийной реакции между NBr-активированной сефарозой и БНФ-П в 0,1 М бикарбонате натрия (pH 8,5), содержащем 0,5 моль/л хлорида натрия, при осторожном перемешивании в течение ночи при 4°С. Полученный гель промывают буфером для присоединения и перемешивают с 1,0 М этаноламином в том же буфере в течение 3 ч при комнатной температуре, затем промывают буфером для присоединения и 0,1 М ацетатом, содержащим 1 моль/л хлорида натрия (pH 3,5). Замещенная матрица для аналитического эксперимента, описанного в разд. 6.4, была получена взаимодействием 1 г активированной сефарозы с 5 мг БНФ-П и содержала по данным аминокислотного анализа 1,4 мг БНФ-П/мл упакованного геля. [c.229]

Применение аффинной хроматографии в качестве метода изучения взаимодействий находится еще на ранней стадии развития, несмотря на то что количественная аффинная хроматография была введена уже десять лет назад [1—3]. Действительно, количество исследований, касающихся методологических аспектов аффинной хроматографии, примерно равно количеству сообщений по применению этого метода в конкретных экспериментальных системах. Большинство этих исследований способствовало применению аффинной хроматографии для оценки равновесия с участием ферментов и модификаторов, ингибиторов или субстратов [1—12], но метод был также использован и для характеристики взаимодействий белок — лекарственный препарат [13], система антиген — антитело [14] и, в меньшей степени, белок-белковых взаимодействий [15, 16]. По существу метод заключается в иммобилизации биоспецифической реагирующей группы X на инертной хроматографической матрице (например, часто на сефарозе) и определении средневзвешенных величин объема элюирования Уа распределяющегося растворенного вещества А в ряде хроматографических экспериментов, в которых растворенное вещество мигрирует в присутствии различных концентраций лиганда 5, также специфически взаимодействующего с А и/или X, В некоторых примерах различные изменения значения Уа отражали конкуренцию между растворенными и иммобилизованными реагентами за одно и то же положение в А [2—5, 7—14] в других изменения в величинахГд были обусловлены наличием взаимодействия иммобилизованного реагента X с бинарным А5-комплексом, образованным растворенным веществом и растворимым лигандом [1, 6]. Цель количественной аффинной хром ографии — объяснить возникновение изменений в величинах Га в предложении существования тех или иных равновесий. Поскольку положение равновесия зависит от концентрации (в соответствии с законом действия масс), точное определение состава смеси реагентов, к которой относится Га, обеспечивает применение фронтальной хроматографии [3, 4]. [c.192]

Ограниченная диффузия возникает, если молекулярная диффузия в порах матрицы затруднена из-за экранирования подхода макромолекул к прикрепленному аффинному лиганду. Экспериментально вклад этой диффузии можно определить с большим трудом, но для аффинной хроматографии на очень пористых носителях эти трудности становятся минимальными. На практике для достижения равновесных условий желательно, чтобы скорость потока была по возможности низкой. Например, при скорости потока 400 мл/ч для выделения стафилококковой нуклеазы на колонке объемом 20 мл небольшие количества нуклеазы появлялись в первом пике вместе с белковыми примесями, особенно если общая концентрация белков в образце была высока (20—30 мг/мл) [5]. Однако даже при такой высокой скорости потока нуклеаза полностью сорбировалась, если наносился менее концентрированный образец. Зависимость связывания лактатдегидрогеназы на №-(6-аминогексил)-5 -АМР — сефарозе от скорости потока пссле-дована Лоу и др. [21]. Было найдено, что увеличение скорости потока относительно мало влияет на сорбцию. При высоких скоростях потока эффективность колонки (ВЭТТ), а также связываемость р уменьшаются. Влияние скорости потока более заметно в небольших колонках, с которых часть белка с ферментативной активностью элюируется со свободным объемом. Влияния концентрации инертного белка (бычьего сывороточного альбумина) при высоких скоростях потока (67 мл/ч) также не обнаружено. [c.84]

Для выделения различных мембранных структур используется и аффинная хроматография. Принцип этого метода заключается в способности выделяемого вещества специфически связываться с лигандом, пришитым к нерастворимому носителю, при пропускании раствора через матрицу. В качестве последней применяют сефарозы (агарозные гели), активируемые путем связывания различных лигандов кофакторов, ингибиторов, субстратов мембранных белков-ферментов, лектинов в случае выделения гликопротеинов гормонов, бромциана, конканавалина А — соответственно при получении мембран, антител или целых клеток, Элюирование исследуемого вещества осуществляют в условиях диссоциации комплекса лиганд — вещество и сохранения нативной структуры выделяемого соединения. [c.221]