Хлоропласты очистка

Интактные хлоропласты можно выделить из листьев табака путем простой гомогенизации и очистки в ступенчатом градиенте плотности фиколла (см. также разд. 4.5). После обработки протеиназой для удаления примесей белков цитоплазмы, включая вновь синтезированную NPT-П, хлоропласты лизируют и изучают ассоциированную с ними ферментативную активность. [c.343]

Фидерные (кормя цне) культуры 161, 166, 225, 231—232 Фиколл, ступенчатый градиент для очистки хлоропластов 345 Флуоресценция, методы окрашивания 180— 181 [c.401]

Дальнейшая очистка препаратов хлоропластов от компонентов клетки осуществляется путем центрифугирования их в ступенчатом градиенте плотности сахарозы. [c.169]

Эти методы служат для разрушения клеток и выделения ферментов в раствор. Если фермент локализован в органеллах, метод может быть использован только при условии, что органеллы также разрушаются. С другой стороны, может понадобиться предварительное выделение самих органелл, что позволит избавиться от загрязнения цитоплазматическими ферментами перед экстракцией фермента из органелл. Для этого требуется менее сильное воздействие. Предварительное растворение поверхностных коллагеновых и целлюлозных структур препаратами гидролитических ферментов позволяет в дальнейшем разрушать клетки более мягкими способами, сохраняя целостность органелл. Примером подобной методики служит получение препаратов митохондрий из таких тканей, как скелетная или сердечная мышцы, под действием протеолитических ферментов [6]. Однако эта методика применима только для получения препаратов в небольших масштабах и больше подходит для. метаболических исследований органелл, чем для очистки ферментов. Выход очищенных органелл может быть очень низким, поэтому во многих случаях лучше сначала разрушить всю ткань, а затем уже приступить к выделению нужного фермента из сложной смеси белков в экстракте. Таким образом, ферменты митохондрий и хлоропластов часто получают из тканевого гомогената, а не из выделенных органелл. [c.42]

В этом разделе кратко рассматриваются методы работы, используемые для выделения ферментов, структурно связанных с нерастворимыми компонентами клетки, такими, как митохондрии, хлоропласты, плазмалемма, эндоплазматический ретикулум и ядерные мембраны. Эти методы не применяются к водорастворимым ферментам, заключенным внутри органелл, например к белкам митохондриального матрикса, а лишь к ферментам, ковалентно связанным или прочно ассоциированным с частицами. Существенной степени очистки по сравнению с исходным материалом можно добиться, многократно промывая гомогенат буфером, в котором данный фермент не растворяется. После этого возможны два подхода к решению проблемы. Можно фракционировать осадок методом дифференциального центрифугирования (седиментация или градиент плотности), с помощью электрофореза или молекулярных сит . [c.52]

При циклическом электронном транспорте ферредоксин может восстанавливать окисленную фор У цитохрома В-типа (цитохрома Ее), имеющего в восстановленном состоянии характерную полосу поглощения в области 563 нм. Цитохром Ве автооксидабе-лен (т. е. может окисляться кислородом воздуха), имеет Е = —0,06 в. Это соединение представляет собой сложный белок — хромопротеид с железосодержащим порфириновым кольцом, в котором содержатся две дополнительные (по сравнению с цитохромами С-типа) винильные группы, увеличивающие систему те-электронов порфирина с 26 до 30. Этот переносчик вымывается из хлоропластов лишь при использовании ионных детергентов. Попытки очистки цитохрома Ве не удались. [c.161]

Для того чтобы исследовать метаболизм углерода, транспорт метаболитов в хлоропластах и компартментацию ферментов в клетке (чему посвящена большая часть этой книги), необходимо прежде всего получить изолированные хлоропласты, которые при этом должны быть интактными, в достаточной степени очищенными от других субклеточных структур и биохимически активными. В некоторых случаях требуется очеиь высокая степень очистки хлоропластов (иапример, для установления локализации тех ферментов, которые присутствуют только в очень небольших количествах), поэтому может оказаться, что гораздо вал<иее освободиться от каких бы то ни было примесей н загрязнений, чем получить хлоропласты, способные осуществлять фотосинтез с очень высокой скоростью. При других обстоятельствах можно поступиться степенью очистки ради сохранения максимального уровня активности, ио наличие примеси цитоплазматических ферментов в препарате может очень усложнить интерпретацию полученных результатов (гл. 8). К тому же важно ие забывать два обстоятельства, которые часто упускают из виду, несмотря на то что это само собой разумеется. Во-первых, абсолютно невозможно получить хорошие хлоропласты из плохого исходного материала (см. разд. А.З). Во-вторых, хорошие хлоропласты будут работать хорошо только тогда, когда с ними будут правильно обращаться. Если оглянуться назад, то станет совершенно ясно, что после того, как в начале 60-х годов в практику были снова введены приемы Хилла, использовавшего в качестве осмотически активного вещества сахара, в плане улучшения методики выделения хлоропластов было сделано очеиь мало, если, конечно, ие считать предварительного получения протопластов (см. разд. А.5). Все последующие улучшения методики, способствующие получению более активных хлоропластов, касались главным образом методики определения активности, и в частности были связаны с введением в среду неорганического пирофосфата (разд. 8.14). [c.543]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология