Дискретный электрофорез в полиакриламидном геле

Рис. 12.10. Аппарат для обесцвечивания столбиков полиакриламидного геля после дискретного электрофореза [78].

Электрофоретическое оборудование обычно работает во влажной атмосфере, причем величины напряжения и силы тока, как правило, превышают безопасные пределы. Неправильное обращение с приборами уже привело к нескольким несчастным случаям со смертельным исходом. Омическое сопротивление человеческого тела, обычно составляющее 10 —10" Ом, существенно зависит от физиологического состояния человека и влажности кожи. Для человека опасен даже ток силой 10 мА, так как при поражении током пострадавший обычно не может сам отсоединиться от проводника. Ток силой более 25 мА вызывает серьезные повреждения в организме —остановку сердца, паралич дыхательных мышц, ожоги и т. д., которые могут привести к смерти. Учитывая, что сопротивление тела 10 Ом, напряжение всего лишь в 100 В способно привести к несчастному случаю в результате уменьшения сопротивления вследствие шока, сопровождающегося потоотделением и (или) повреждением кожи, опасно даже меньшее напряжение. Таким образом, приборы для электрофореза и изоэлектрического фокусирования, являющиеся источниками электрического тока, могут представлять опасность для жизни. Если источники питания стабилизованы, то опасность возрастает, так как напряжение во время разъединения проводов или разрыва проводящих соединений в электрофоретической камере увеличивается. При работе на приборе для дискретного электрофореза в полиакриламидном геле, который обычно снабжен стабилизованным источником питания, риск часто недооценивают. [c.327]

Дискретный электрофорез Многофазный зонный электрофорез Электрофорез в градиенте плотности полиакриламидного геля (электрофорез, определяемый размером пор) [c.282]

МЕТОДИКА АНАЛИТИЧЕСКОГО ДИСКРЕТНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ [c.302]

Выбранные системы и состав гелей и буферных растворов для дискретного электрофореза в полиакриламидном геле в соответствии с молекулярной массой и зарядом образца [c.303]

ДИСКРЕТНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ [c.300]

Рис, 12.9. Схема дискретного колоночного электрофореза в полиакриламидном геле. [c.301]

Фракционирование (т.е. разделение) фрагментов ДНК по размеру и длине проводится с помощью электрофореза на поверхности агарозного или полиакриламидного геля. Под действием электрического поля фрагменты ДНК начинают перемещаться вниз по гелю со скоростью, зависящей от их длины. (Чем короче фрагменты, тем быстрее они движутся). В результате каждый фрагмент ДНК занимает определенное положение в виде дискретной полосы в конкретном месте геля. Длину каждого фрагмента можно определить путем сравнения расстояния, пройденного им и стандартным (с известными размерами) отрезком ДНК. [c.36]

Наряду с основными методами существует ряд смещанных методов, среди которых дискретный электрофорез в полиакриламидном геле играет важную роль в разделении биополимеров. В этом методе сначала используются некоторые элементы изо-тахофореза, который через некоторое время заменяется на зонный электрофорез в среде геля, однако в геле могут иметь место и молекулярно-ситовые эффекты. [c.281]

Полиакриламидный гель наименее химически активен. Его> слабое сродство к красителям позволяет осуществлять быстрое обнаружение биополимеров, главным образом белков, нуклеиновых кислот и продуктов их деградации, с помощью окрашивания. Прозрачный полиакриламидный гель обладает хорошими механическими свойствами, допускающими изменение концентрации полиакриламида в самых широких пределах. Электроос-мотические эффекты в этом геле очень малы. Условия аналитических и препаративных разделений на полиакриламидном геле путем зонного электрофореза в гомогенных и дискретных системах буферных растворов [48, 77], а также изотахофореза и изо-электрического фракционирования хорошо изучены. [c.299]

Рис. 12.29. Аналитическое разделение белков и полипептидов методом дискретного электрофореза в колонках с полиакриламидным гелем.

Гель-электрофорез в дискретной системе буферов был впервые использован Пуликом [77], а теория метода (применительно к полиакриламидному гелю) была разработана Дэвисом [c.300]

И Орнштейном [73]. Метод дискретного электрофореза, описанный этими авторами, или метод так называемого многофазного [48] зонного электрофореза в полиакриламидном геле, предусматривает объединение двух основных принципов электромиграции. На начальной стадии разделения происходит процесс фокусирования, сходный с изотахофорезом (см. разд. 12.3), который постепенно трансформируется в процесс зонного элек- [c.301]

Электрофорез фрагментов ДНК обеспечивает разделение этих фрагментов при их распределении на поверхности агарозного или полиакриламидного геля. Фрагменты ДНК движутся в геле, помещённом в постоянное электрическое поле, от отрицательного полюса к положительному в зависимости от размеров (чем больше относительная молекулярная масса фрагмента, тем медленнее он движется в электрическом поле). После окончания электрофореза каждый фрагмент ДНК занимает определённое положение в виде дискретной полосы в конкретном месте геля. Длину каждого фрагмента можно определить путём [c.262]

Изоэлектрическое фокусирование в геле имеет определенные преимущества по сравнению с ИФ в среде со стабилизованным градиентом плотности. Эти преимущества состоят в следующем 1) сокращается длительность разделения 2) полностью подавляется термическая конвекция 3) применяется простое оборудование для ИФ 4) возможно одновременное разделение нескольких образцов 5) возможно обнаружение с помощью различных красителей и различных методик 6) возможно объединение ИФ и зонного электрофореза в двухмерном варианте 7) достаточно небольшого количества образца 8) возможно обнаружение белков методом иммунодиффузии. Однако при применении геля возникают проблемы, связанные с молекулярноситовым эффектом, который имеет место в основном при разделении больших молекул. Другой недостаток метода — это низкая точность определения pH в зонах. В настоящее время этот метод (сокращенное обозначение ИФПАА или ПАГИФ) является общепринятым и широко используется. В отдельных случаях, согласно данным [73], при проведении дискретного трубчатого электрофореза в полиакриламидном геле доо пска-ется окрашивание. Для снижения молекулярно-сито<вого эффекта рекомендуется [23] концентрация геля 3,7%. Типичный градиент напряжения для 8-часового разделения составляет 200 В на 60 мм. Если тепло отводится, то напряжение можно увеличить и соответственно сократить длительность разделения. Градиент pH можно измерить после разрезания столбиков с гелем и последующего элюирования сегментов небольшим коли- [c.323]

Зоны окрашивают так же, как описано для дискретного электрофореза в полиакриламидном геле. Наиболее чувствительным является обнаружение с помощью кумасси синего R250 (Serva, Гейдельберг) 1,25 г этого красителя растворяют в 227 мл метанола и добавляют 46 мл уксусной кислоты. Раствор разбавляют водой до 500 мл и фильтруют. Гели высушивают в течение 2—12 ч. Обесцвечивание проводят в растворе, содержащем 50 мл метанола и 75 мл уксусной кислоты в 1000 мл воды, путем диализа или электрофореза (см. выше). [c.347]

Дальнейшее повышение разрешения обеспечивает двухмерный электрофорез. Описано множество различных комбинаций, таких, например, как электрофорез на фильтровальной бумаге в первом направлении и электрофорез в крахмальном геле — во втором [1031] электрофорез на ацетате целлюлозы в первом направлении и ИЭФ — во втором [944] ИЭФ на первом этапе и электрофорез в полиакриламидном геле — на втором [270, 1127]. Самые лучшие результаты получают при использовании на первом этапе электрофореза в мягких полиакриламидных гелях или ИЭФ, а на втором — электрофореза в градиенте концентрации полиакриламидного геля. Таким путем Райт [1452] изучал белковый состав нормальных сывороток и сывороток больных с некоторыми видами злокачественных опухолей (рис. 103). Основные классы иммуноглобулинов давали при этом дискретные зоны. Постальбуминовая зона разделялась [c.333]