Электрофорез дискретный

Еще лучшее разделение дает диск-электрофорез [40, 41], при котором используют дискретную (прерывающуюся) разделительную систему из различных буферных растворов и работают с акриламидными гелями, имеющими различные размеры пор. Несколько (минимум два) слоев геля с различными pH наслаивают один на другой, благодаря чему процессу разделения предшествует концентрирование компонентов и в результате получаются очень узкие полосы белков. [c.351]

Зонный электрофорез является самым простым из описанных здесь способов разделения. Так как многие методы анализа, которые будут обсуждаться ниже, основаны на КЗЭ, необходимо детально рассмотреть его основные принципы. При зонном электрофорезе буфер, значение pH, а также напряженность поля во всем пространстве разделения остаются постоянными. Пробы разделяются за счет их различных подвижностей. Они вводятся в виде отдельной зоны на входе в капилляр и обнаруживаются в виде дискретных, отделенных друг от друга зон на конце детектора. Назначение буфера при этой технике разделения - поддерживать постоянное значение pH и обеспечивать транспортный поток. Выбор pH буфера определяет заряд ионов пробы. Концентрация буфера влияет на ЭОП. Для дальнейшей оптимизации могут использоваться добавки к буферу. [c.48]

Для разделения белков и нуклеиновых кислот широко применяется метод гель-электрофореза. Его принцип заключается в следующем. Исследуемый препарат (раствор белка, ДНК или РНК) вносят в лунку, расположенную у края геля — полужидкой среды с сетчатой пространственной структурой (обычно для электрофореза используют тонкие пластины геля). Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, и когда через гель пропускают электрический ток, они перемещаются в электрическом поле. Молекулы одинакового размера (и одинакового заряда) движутся единым фронтом, образуя в геле дискретные невидимые полосы. Чем меньше размер молекул, тем быстрее они движутся. Постепенно исходный препарат, состоящий из разных макромолекул, разделяется на зоны, распределенные по длине пластинки. [c.54]

За ходом электрофореза следят по перемещению в геле красителя -заряженного низкомолекулярного вешества, которое вносят в каждую лунку перед началом электрофореза. Когда краситель достигает конца пластины, электрофорез останавливают, а гель окрашивают красителем, прочно связывающимся с белками или нуклеиновыми кислотами. Если образец представляет собой дискретный набор макромолекул разного размера, то после электрофореза получается набор четких полос, рас- [c.54]

Возможность применения неоднородных (дискретных) систем электролитов в многофазном зонном электрофорезе используется недостаточно полно. Об этом, в частности, говорят результаты анализа расчетных систем электролитов в условиях фокусирования, ограниченного [16, 73] или неограниченного во времени. [c.281]

Дискретный электрофорез Многофазный зонный электрофорез Электрофорез в градиенте плотности полиакриламидного геля (электрофорез, определяемый размером пор) [c.282]

ДИСКРЕТНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ [c.300]

Рис, 12.9. Схема дискретного колоночного электрофореза в полиакриламидном геле. [c.301]

МЕТОДИКА АНАЛИТИЧЕСКОГО ДИСКРЕТНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ [c.302]

Выбранные системы и состав гелей и буферных растворов для дискретного электрофореза в полиакриламидном геле в соответствии с молекулярной массой и зарядом образца [c.303]

Состав растворов для получения разделяющих гелей при дискретном электрофорезе (приведенные номера систем [c.304]

Электродные буферные растворы для дискретного электрофореза (приведенные номера смесей соответствуют указанным в табл. 12.6) [c.306]

Рис. 12.10. Аппарат для обесцвечивания столбиков полиакриламидного геля после дискретного электрофореза [78].

Гораздо более эффективным методом обесцвечивания является электродиализ. Этот метод используется для быстрого выявления зон с высокой концентрацией белка. Для проведения электролиза достаточно простого нестабилизованного источника постоянного напряжения. Требуемый ток зависит от направления электродиализа в геле. С помощью электродных сосудов и источника питания, аналогичных применяемым при дискретном электрофорезе, удается осуществить более длительный и более сложный продольный электродиализ. Гели, имеющие форму круглых столбиков, помещают в трубки, диаметр которых лишь немного больше диаметров столбиков. В нижней части трубки сужаются, так что гель образует затвор. Электродные камеры и трубки с гелем заполняют 7%-ной уксусной кислотой. После включения тока за процессом обесцвечивания можно наблюдать визуально. Наиболее быстрым методом обесцвечивания является электродиализ в направлении, перпендикулярном длинной оси геля. Для проведения обесцвечивания разработаны специальные приборы, выпускаемые рядом фирм. В маленьком приборе конструкции Прусика [78] обесцвечивание можно провести за 30—45 мин. Этот прибор (рис. 12.10) можно легко изготовить в любой лаборатории. [c.309]

Электрофоретическое оборудование обычно работает во влажной атмосфере, причем величины напряжения и силы тока, как правило, превышают безопасные пределы. Неправильное обращение с приборами уже привело к нескольким несчастным случаям со смертельным исходом. Омическое сопротивление человеческого тела, обычно составляющее 10 —10" Ом, существенно зависит от физиологического состояния человека и влажности кожи. Для человека опасен даже ток силой 10 мА, так как при поражении током пострадавший обычно не может сам отсоединиться от проводника. Ток силой более 25 мА вызывает серьезные повреждения в организме —остановку сердца, паралич дыхательных мышц, ожоги и т. д., которые могут привести к смерти. Учитывая, что сопротивление тела 10 Ом, напряжение всего лишь в 100 В способно привести к несчастному случаю в результате уменьшения сопротивления вследствие шока, сопровождающегося потоотделением и (или) повреждением кожи, опасно даже меньшее напряжение. Таким образом, приборы для электрофореза и изоэлектрического фокусирования, являющиеся источниками электрического тока, могут представлять опасность для жизни. Если источники питания стабилизованы, то опасность возрастает, так как напряжение во время разъединения проводов или разрыва проводящих соединений в электрофоретической камере увеличивается. При работе на приборе для дискретного электрофореза в полиакриламидном геле, который обычно снабжен стабилизованным источником питания, риск часто недооценивают. [c.327]

Рис. 12.29. Аналитическое разделение белков и полипептидов методом дискретного электрофореза в колонках с полиакриламидным гелем.

В большинстве современных методов электрофореза для предотвращения смешивания зон миграция ионов проводится в пропитанных электролитом пористых инертных средах. Для этой цели используются фильтровальная бумага, стеклянное волокно, стеклянный или кварцевый порошок, крахмал, агар-агар. Во всех этих наполнителях миграция ионов должна начинаться из первоначально узкой зоны. Различная подвижность ионов приводит к полному разделению смеси с образованием дискретных зон, аналогичных зонам при хроматографическом разделении. [c.36]

Однако было обнаружено, что при электрофорезе в 0,1 М бо-ратном буфере (pH 9,1) на стекловолокне токсин двигался как единая дискретная полоса, токсичность точно соответствовала тому материалу, который давал положительную реакцию на пептиды с реагентом — U—KJ—толидин. Если вместо стекловолокна использовали 3 мм ватман, то через 6 час. электрофорез (при 650 в и 25 ма) давал полное разделение экстракта на 5 компонентов. [c.161]

Рис. 114. Электрофорез в агарозном геле спинномозговой жидкости (СМЖ) и сыворотки крови, полученных от шести разных больных [772]. По краям электрофореграммы расположены образцы нормальной сыворотки, использованные в качестве свидетелей. 1, 3, 5, 7, 9 и И — образцы концентрированной СМЖ, остальные номера — образцы сыворотки. 1 и 2 — образцы от больного с хронической миелопатией 3 и 4, 5 ц 6, 7 и 8, 9 и 10 — образцы от четырех больных с рассеянным склерозом И и 12 — образцы от больного с опухолью центральной нервной системы. Стрелки, направленные вправо, указывают на дискретные зоны, присутствующие в СМЖ здоровых людей стрелки направленные влево, указывают на зоны в У"ГЛобулиновой области, отсутствующие у здоровых людей.

Напомним, что заряд электрона е=- 1,6 10 Кл, т. е. в среднем заряд частицы соответствует всего лишь нескольким (около четырех) элементарным зарядам. Наблюдая за частицами масла в опытах по электрофорезу капель масляного тумана (на фоне их броуновского движения), Миллике1[ показал, что заряд частиц всегда оказывается кратным одной и той же величине 1,6 10 Кл. Это позволило доказать дискретный характер электрического заряда и определить величину элементарного заряда. [c.331]

Наряду с основными методами существует ряд смещанных методов, среди которых дискретный электрофорез в полиакриламидном геле играет важную роль в разделении биополимеров. В этом методе сначала используются некоторые элементы изо-тахофореза, который через некоторое время заменяется на зонный электрофорез в среде геля, однако в геле могут иметь место и молекулярно-ситовые эффекты. [c.281]

Полиакриламидный гель наименее химически активен. Его> слабое сродство к красителям позволяет осуществлять быстрое обнаружение биополимеров, главным образом белков, нуклеиновых кислот и продуктов их деградации, с помощью окрашивания. Прозрачный полиакриламидный гель обладает хорошими механическими свойствами, допускающими изменение концентрации полиакриламида в самых широких пределах. Электроос-мотические эффекты в этом геле очень малы. Условия аналитических и препаративных разделений на полиакриламидном геле путем зонного электрофореза в гомогенных и дискретных системах буферных растворов [48, 77], а также изотахофореза и изо-электрического фракционирования хорошо изучены. [c.299]

Гель-электрофорез в дискретной системе буферов был впервые использован Пуликом [77], а теория метода (применительно к полиакриламидному гелю) была разработана Дэвисом [c.300]

И Орнштейном [73]. Метод дискретного электрофореза, описанный этими авторами, или метод так называемого многофазного [48] зонного электрофореза в полиакриламидном геле, предусматривает объединение двух основных принципов электромиграции. На начальной стадии разделения происходит процесс фокусирования, сходный с изотахофорезом (см. разд. 12.3), который постепенно трансформируется в процесс зонного элек- [c.301]

Изоэлектрическое фокусирование в геле имеет определенные преимущества по сравнению с ИФ в среде со стабилизованным градиентом плотности. Эти преимущества состоят в следующем 1) сокращается длительность разделения 2) полностью подавляется термическая конвекция 3) применяется простое оборудование для ИФ 4) возможно одновременное разделение нескольких образцов 5) возможно обнаружение с помощью различных красителей и различных методик 6) возможно объединение ИФ и зонного электрофореза в двухмерном варианте 7) достаточно небольшого количества образца 8) возможно обнаружение белков методом иммунодиффузии. Однако при применении геля возникают проблемы, связанные с молекулярноситовым эффектом, который имеет место в основном при разделении больших молекул. Другой недостаток метода — это низкая точность определения pH в зонах. В настоящее время этот метод (сокращенное обозначение ИФПАА или ПАГИФ) является общепринятым и широко используется. В отдельных случаях, согласно данным [73], при проведении дискретного трубчатого электрофореза в полиакриламидном геле доо пска-ется окрашивание. Для снижения молекулярно-сито<вого эффекта рекомендуется [23] концентрация геля 3,7%. Типичный градиент напряжения для 8-часового разделения составляет 200 В на 60 мм. Если тепло отводится, то напряжение можно увеличить и соответственно сократить длительность разделения. Градиент pH можно измерить после разрезания столбиков с гелем и последующего элюирования сегментов небольшим коли- [c.323]

Зоны окрашивают так же, как описано для дискретного электрофореза в полиакриламидном геле. Наиболее чувствительным является обнаружение с помощью кумасси синего R250 (Serva, Гейдельберг) 1,25 г этого красителя растворяют в 227 мл метанола и добавляют 46 мл уксусной кислоты. Раствор разбавляют водой до 500 мл и фильтруют. Гели высушивают в течение 2—12 ч. Обесцвечивание проводят в растворе, содержащем 50 мл метанола и 75 мл уксусной кислоты в 1000 мл воды, путем диализа или электрофореза (см. выше). [c.347]

Притц [73, 74] описал метод противоточного электрофореза. В этом методе стационарные зоны разделяемых компонентов автоматически устанавливаются при электрофорезе в трубке с ламинарным противотоком раствора электролита. В данном случае устанавливается также дискретное ступенчатое распределение напряженности поля, зависящее от концентрации компонентов в зонах в соответствии с соотношением Кольрауша. В свою очередь, эти концентрации определяются подвижностями разделяемых ионов и концентрацией противоточного раствора. Из соотношения можно [c.52]

Прямое определение нуклеотидной последовательности сателлитной ДНК может оказаться сложным. Можно попытаться сделать это, используя дискретный набор по-х ледовательностей, получаемых при расщеплении ДНК рестриктазами. Однако при наличии существенных различий между нуклеотидными последовательностями отдельных повторяющихся единиц в одном и том же положении разных повторов будут находиться разные нуклеотиды, поэтому при электрофорезе получится нечеткая картина. Если различия не слишком велики, скажем находятся в пределах 20%, то можно непосредственно выявить повторяющуюся единицу усредненного состава. [c.303]

При гель-электрофорезе транскриптов, образовавшихся в условиях преждевременной терминации, как правило, не обнаруживается дискретных больших фрагментов. Л ежду тем некоторые последовательности, по-видимому, содержат внутренние слабые сайты терминации в результате в геле обнаруживаются полосы, соответствующие достаточно большим, но неполноразмерным траискриптам. Количество таких полос уменьшается по мере возрастания количества полноразмерных транскриптов при использовании более высоких концентраций нуклеотидов, но даже при самых высоких концентрациях они никогда не исчезают полностью. Именно эти дискретные продукты, получающиеся в результате преждевременной терминации, служат основным источником трудностей прн анализе результатов опытов по защите от действия РНКазы. Следовательно, требуется проводить анализ меченого зонда с помощью гель-электро-фореза до его использования, особенно в случае экспериментов по защите от РНКазы. [c.24]

В последние годы предприняты попытки выделить различные субъединичные комплексы из дезинтегрированных детергентами мембран хлоропластов. Используя метод электрофореза, Л. И. Фрадкин выделил из обработанного дигитонином мембранного материала дискретный набор субмембранных частиц, имеющих размер по- [c.48]

В ранних стадиях исследования было обнаружено, что хотя бы один из двух белков Р ассоциирован с рибонуклеопротеидным комплексом вирионов [25, 58, 257, 259]. По мере совершенствования условий электрофореза в ПААГ стало ясно, что вирион содержит три дискретных белка Р [112, 133, 200], которые обозначили Р1, Р2, РЗ по порядку уменьшения их электрофоретической подвижности в ПААГ (выявленная м. м. 95 000—82 000). На основе анализа рекомбинантов штаммов A/PR/8/34 и А/НК/68 определили, что 1-й сегмент РНК кодирует белок РЗ, 2-й сегмент РНК — белок Р1 и 3-й сегмент РНК — белок Р2 [194, 217], но у штамма A/FPV/Rosto k/34 кодируемые назначения сегментов РНК отличались [242]. Поскольку обозначение Р1—РЗ, согласно номенклатуре, основано на подвижности в геле, а не на функция , белок Р2 одного штамма может быть функционально эквивалентен белку РЗ другого штамма [7]. [c.42]

Дальнейшее повышение разрешения обеспечивает двухмерный электрофорез. Описано множество различных комбинаций, таких, например, как электрофорез на фильтровальной бумаге в первом направлении и электрофорез в крахмальном геле — во втором [1031] электрофорез на ацетате целлюлозы в первом направлении и ИЭФ — во втором [944] ИЭФ на первом этапе и электрофорез в полиакриламидном геле — на втором [270, 1127]. Самые лучшие результаты получают при использовании на первом этапе электрофореза в мягких полиакриламидных гелях или ИЭФ, а на втором — электрофореза в градиенте концентрации полиакриламидного геля. Таким путем Райт [1452] изучал белковый состав нормальных сывороток и сывороток больных с некоторыми видами злокачественных опухолей (рис. 103). Основные классы иммуноглобулинов давали при этом дискретные зоны. Постальбуминовая зона разделялась [c.333]

Основной эксперимент заключался в следующем. Выделенные мини-хромосомы вируса SV40 обрабатывали топо I, затем выделяли из контрольных и обработанных ферментом мини-хромосом ДНК и сравнивали их с помощью высокоразрешающего электрофореза в агарозном геле, при проведении которого происходит разрещение топоизомеров ДНК, т. е. две одинаковые ДНК, различающиеся всего на один супервиток, видны как две разные дискретные полосы. Оказалось, что ДНК, выделенные из обработанных топо I и контрольных мини-хромосом, содержат одинаковые наборы топоизомеров, обе негативно закручены и вообще неразличимы между собою. Следовательно, топо I не вносила изменений в ДНК, когда последняя была в составе мини-хромосомы. Отсюда вытекает, что ДНК в составе хроматина находится в равновесном, энергетически наиболее выгодном состоянии, и упругие торзионные напряжения в ней отсутствуют. [c.175]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология