Полипептиды твердофазным методом

Весьма перспективным методом синтеза пептидов является твердофазный метод, заключающийся в присоединении карбоксильной группы аминокислоты к нерастворимому полимеру посредством сложноэфирной связи. Затем к первой аминокислоте присоединяют следующую, предварительно отщепив защитную группу В результате образуется дипептид, по-прежнему присоединенный к носителю. Такие циклы можно повторять многократно, получая полипептиды необходимой длины. [c.24]

Большой интерес представляют исследования по созданию новых экспресс-методов синтеза полипептидов. К ним относятся работы Д. Г. Кнорре, предложившего метод синтеза пептидов в водном растворе без выделения промежуточных соединений, распространенный недавно на синтез аминокислотных производных нуклеиновых кислот. Новые возможности открывает и метод синтеза пептидов на полимерном носителе недавно был предложен метод синтеза пептидов на полимере в растворе, имеющий ряд преимуществ в сравнении с ранее известным твердофазным методом с помощью синтеза на полимерной подложке недавно был получен ряд природных пептидов, в частности гипертензии (Л. А. Щукина). [c.515]

Удивительно простая идея этого нового метода синтеза состоит в том, что аминокислота закрепляется через свою карбоксильную группу на нерастворимом легко фильтруемом полимере, и затем пептидная цепь постепенно наращивается с С-конца. Для этой цели К-замещенные аминокислоты вводят в реакцию с реакционноспособными группами полимерной смолы. С аминокислоты, ковалентно соединенной с полимерной частицей, удаляется Ы-защитная группа, и полученный аминоацильный полимер реагирует со следующей Ы-защищенной аминокислотой. Пептидная цепь ступенчато наращивается на полимерной матрице. На последней стадии синтеза Меррифилда расщепляется ковалентная связь между С-концевой аминокислотой построенной полипептидной цепи и якорной группировкой полимерного носителя. Нерастворимый носитель может быть отделен от находящегося в растворе полипептида простым фильтрованием. Решающее преимущество метода Меррифилда состоит в том, что избегают трудоемких и требующих много времени операций по очистке промежуточных продуктов. Ценный продукт реакции все время остается прикрепленным к полимерному носителю, в то время как избытки реагентов и побочные продукты удаляются фильтрованием. Простота эксперимента и возможность автоматизации привели сначала даже к мнению, что благодаря этой новой синтетической концепции будет, наконец, решена проблема химического синтеза ферментов и других белков. Однако после подробного изучения и интенсивной разработки этой новой техники синтеза были выявлены серьезные лимитирующие факторы, которые впоследствии привели к реалистической Оценке этого метода. Конечно, сведение трудных стадий высаживания и очистки при обычных методах в растворе к простому процессу фильтрования в твердофазном синтезе уже означает неоспоримое преимущество. [c.179]

Если проанализировать все проведенные синтезы Меррифилда (табл. 2-9), то станет ясно, что это в основном работы в период между 1968 и 1972 гг. В это время во многих новых лабораториях — а их количество в США со времени опубликования концепции Меррифилда увеличилось в десять раз — начали проводить синтезы пептидов на носителях, чему в значительной степени способствовала коммерческая доступность синтезаторов. Очевидно, разочаровывающие результаты при попытках синтеза белков привели к реалистической оценке возможностей метода. Попытка синтеза лизо-цима привела, например, к смеси полипептидов, которая обладала 0,5—1% специфической активности [455]. Гораздо успешнее был синтез рибонуклеазы А [449], хотя и в этом случае выход составлял всего 16%. На этом ферменте с помощью твердофазной техники проведено интересное изучение взаимосвязи строения и активности [467]. Несомненно, что биологическая активность не является критерием гладкого течения твердофазного синтеза. Синтез белка, состоящего из 188 аминокислот, который сначала считали гормоном роста человека, дал смесь белков с заметной биологической активностью. Несколько позднее было, однако, показано, что положенная в основу синтеза первичная структура не подтвердилась [453, 468]. Синтез длинноцепочечных пептидов и белков по методу Меррифилда в настоящее время и в обозримом будущем уже не может отвечать тем высоким требованиям, которые предъявляются к синтезу биологически активных соединений. [c.193]

Более совершенным и эффективным оказался разработанный в конце XX в. Р. Б. Меррифилдом и широко используемый в настоящее время метод автоматического твердофазного синтеза пептидов, позволивший автоматизировать данный процесс и снизить механические потери. Сущность данного метода состоит в том, что первый мономер во вновь строящейся цепи синтезируемого полипептида ковалентно связывается с нерастворимым полимерным носителем, а все последующие стадии проводятся [c.53]

Решение научной проблемы (например, такой, как создание твердофазного метода для быстрого автоматического синтеза полипептидов) часто имеет большие практические и научные последствия. Например, несколько видоизмененная твердофазная методика уже сейчас применяется для синтеза полидезоксирибо-иуклеотидов с заданной последовательностью оснований. Значение этого трудно переоценить. Такие синтезы не только способствуют познанию основных генетических механизмов онг также показывают, что скоро станет возможным получение синтетических генов, которые можно будет использовать в качестве дополнения к естественному набору генов данного организма. И хотя сейчас это звучит как научная фантазия, научные применешш и социальные последствия такого синтеза являются предметом серьезного обсуждения среди биохимиков. [c.405]

Химический синтез полимеров с заданной последовательностью мономерных звеньев может быть очень сильно облегчен присоединением одного конца растущей полимерной цепи к нерастворимой подложке. При этом очистка полимера после каждой стадии химической реакции может легко достигаться фильтрованием. Этот метод был очень популярен в области пептидов, при этом повторяющиеся стадии могут быть автоматизированы [88]. Твердофазный синтез полинуклеотидов не был столь успещен, как твердофазный синтез полипептидов, в основном из-за трудностей в достижении количественных выходов на последовательных стадиях синтеза. Наиболее полезными реагентами для создания межнуклеотидной связи являются аренсульфонилхлориды, хотя для достижения максимальных выходов необходимо обеспечение безводных условий. Полистирол и сщитые стирол-дивинилбензольные сополимеры, содержащие остатки 4-метокситритилхлорида, были использованы для присоединения первого нуклеозида, через его 5 -гидроксильную группу к твердой подложке схема (55) . [c.170]

Биохимия является в основном экспериментальной наукой. Она опирается на арсенал методов, созданных неорганической, органической, аналитической и физической химией. Однако многие из задач, с которыми сталкиваются биохимики, вследствие специфики изучаемых объектов требуют нетрадиционных подходов. В первую очередь это касается изучения биополимеров. Например, химический синтез белков представляет собой повторение десятки или даже сотни раз реакции образования пептидной связи с целью последовательного присоединения на каждой стадии к растущей полимерной цепи определенного аминокислотного остатка. Образование пептидных связей прекрасно отработано и с точки зрения классической органической химии не представляет ни трудности, ни интереса. Но необходимость проводить последовательно множество таких превращений без существенного уменьшения выхода, без повреждения уже созданной на предыдущих этапах синтеза полипептидной цепи ставит свои специфические проблемы, которые решаются оригинальными, разработанными именно для таких задач приемами. Венцом этих приемов является автоматический твердофазный синтез полипептидов. Столь же не традиционно выглядит задача устанобления химического строения биополимеров. Структуры отдельных мономерных звеньев как белков, так и нуклеиновых кислот давно установлены с использованием классических методов органической химии, и задача сводится к тому, чтобы для каждого конкретного биополимера определить, в каком порядке в изучаемой полимерной цепи располагаются разнотипные мономерные звенья. [c.10]

Специфической особенностью полипептидного синтеза является огромное число идентичных стадий, которые необходимо проводить на каждом этапе удлинения цепи образование новой пептидной связи, удаление защитной группы для подготовки к следующей стадии элонгации цепи и промежуточные отмывки от избытка реагентов и, побочных продуктов после каждого химического превращения. Метод, предложенный Робертом Меррифилдом, дал возможность автоматизировать этот процесс и снизить механические потери. Согласно этому методу, первый мономер во вновь строящейся цепи синтезируемого полипептида ковалентно связывается с нерастворимым носителем (смолой) и все последующие стадии проводятся с полипептидом, растущим на этой смоле. Этот метод известен как твердофазный синтез полипептидов. К смоле попеременно добавляют очередной синтон и реагент для удаления концевой защитной группы, остаток). Химические стадии перемежаются соответствующими промывками. В течение всего процесса полипептид остается связанным со смолой. Поместив в колонку смолу, с которой связан синтезируемый пОлипептид, можно легко автоматизировать процесс, запрограммировав смену потоков через колонку синтон (мономер) — растворитель — смесь для удаления защиты — растворитель и т.д. Разработаны специальные приборы для автоматизированного полипептидного синтеза. Так, уже упоминавшийся синтез протеазы ВИЧ-1 провели на автоматическом пептидном синтезаторе <АррИе(1 Biosystem> и потребовалось около двух-10- 291 [c.291]

Синтез. Осуществление белкового синтеза химическим путем привлекало внимание многих исследователей. Метод твердофазного синтеза, разработанный Б. Меррифилдом, дал возможность получать достаточно большие полипептиды. Таким же способом был получен гормон инсулин, а его уже можно отнести к классу белков. В случае инсулина более трудной задачей было соединение двух полипептидных цепей в активную макромолекулу. К. Диксон и А. Уардлоу справились с этой задачей и положили основу химического синтеза белков. Однако несмотря на разработку автоматических синтезаторов, метод химического синтеза белков не получил щирокого распространения из-за наличия большого числа технических ограничений. В природе небольшие полипептиды синтезируются с помощью соответствующих ферментов, основная же масса белков образуется посредством матричного синтеза. [c.40]

Был секвенирован один из клонов с наиболее короткой последовательностью ДНК, кодирующей эпитоп РАЬ204 в белке р68. Его аминокислотная последовательность была сопоставлена с последовательностью длиной 63 аминокислоты внутри большого Т-антигена, включающей эпитоп. Методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) изучали взаимодействие серии из четырех синтетических полипептидов, соответствующих этому участку, с РАЬ204. В результате было установлено, что эпитоп представляет собой участок длиной 17 амино- [c.201]

Для устранения потерь с промывками образца был предложен твердофазный (ТФ) метод анализа [И] Благодаря ковалентному присоединению изучаемого полипептида к химически модифицированной матрице носителя (па основе стекла или полистирола) исключены потери образца при промывке его органическими растворителями в процессе отщепления аминокислот. Простота конструкции колонки-реактора ТФ-секвепа-тора облегчает ее миниатюризацию, что позволяет повысить чувствительность определения последовательности. В то же время ковалентное присоединение пептидов и белков к носителю в гетерогенной системе пе так просто осуществить, а выходы на этой стадии составляют лишь 20—50%. Реакции связывания белка (пептида) с матрицей носителя проводятся вне секвенатора, они весьма трудоемки и требуют длительного времени. Необходимо отметить, что планирование эксперимен- [c.464]

С помощью классических химических методов удалось синтезировать октапептиды вазопрессин и окситоцин, а позднее—брадикинин, однако выходы конечного продукта были столь низкими, что нельзя было надеяться на возможность синтеза более длинных полипептидов или белков. Эту задачу удалось решить методом автоматического твердофазного синтеза, разработанным Меррифидцом. Весь процесс проводится в одном сосуде, в который автоматически по заданной программе, через определенные промежутки времени, добавляются реагенты, удаляются продукты и т. д. Процесс состоит из следующих этапов. [c.40]